1、[研究背景]環(huán)核苷酸依賴的磷酸二酯酶(Cyclicnucleotide-dependent phosphodiesterase,PDE)是一超家族酶系,包括11種亞型50多種基因型,主要功能是水解細(xì)胞內(nèi)第二信使cGMP和cAMP,后者在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、血管張力及細(xì)胞外基質(zhì)表達等功能中發(fā)揮重要作用。既往對于PDE的研究多集中于肺成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC

2、)和內(nèi)皮細(xì)胞等。研究表明干預(yù)PDE2、PDE3和PDE4的功能可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞生長、遷移、基質(zhì)表達。在血管方面,研究較多的是PDE1A亞型,它參與了VSMC增殖、凋亡、表型轉(zhuǎn)化和血管張力的調(diào)節(jié)。近年來血管外膜在血管重塑中的作用日益受到重視。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta1,TGF-β1)可以誘導(dǎo)血管外膜成纖維細(xì)胞(adventitial fibroblast,

3、AF)向肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MF)轉(zhuǎn)化,后者的標(biāo)志是胞漿中出現(xiàn)α平滑肌肌動蛋白(alpha-smoothmuscle actin,α-SM actin),蛋白激酶Ca(PKCα)信號涉及這一分化過程。PDElA屬于鈣調(diào)蛋白(Ca2+/Camodulin,Ca2+/CAM)超家族,水解cGMP的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強于水解cAMP。有研究表明PDE1A陽性細(xì)胞在球囊損傷的血管外膜表達顯著增加；我們也發(fā)現(xiàn)PDE1A mRNA在VA

4、F表達較高,且是PDE1亞型主要的同工酶。但PDE亞型是否能夠調(diào)節(jié)VAF的功能以及PDE1A的作用如何,目前尚無報道。
　　 [目的]觀察18種PDE亞型在VAF中的基因表達譜,研究PDE1A在VAF表型轉(zhuǎn)化和膠原表達調(diào)節(jié)中的作用。
　　 [方法]貼壁法培養(yǎng)SD(Sprague Dawley rat)大鼠胸主動脈VAF。采用熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Real Time RT-PCR)檢測18種PDE亞型mRNA的表達；D

5、NA鏈末端合成終止法進行測序檢驗擴增產(chǎn)物與目的基因序列的一致性。蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot)檢測細(xì)胞Ⅰ型膠原、PDElA、α-SM actin(作為MF轉(zhuǎn)化標(biāo)志)及蛋白激酶Ca(PKCα)蛋白的表達,同時免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測α-SM actin的表達。
　　 [結(jié)果]
　　 1.PDE亞型在VAF中的表達:實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示14種PDE亞型mRNA在VAF表達。根據(jù)表達量高低,依次為PDE5A,

6、PDE1A,PDE8A,PDE4B,PDE4D,PDE1C2,PDE3B,PDE10A,PDE7A,PDE2A,PDE3A,PDE4A,PDE1B,PDE9A。隨機選取4個擴增產(chǎn)物測序結(jié)果證實均與目的基因匹配。而PDE4C,PDE7B,PDE8B,PDE11A4種PDE亞型不表達。此外,免疫細(xì)胞化學(xué)方法也證實了PDE1A蛋白在VAF中有表達。
　　 2.PDE1A在AF表型轉(zhuǎn)化中的作用:免疫印跡結(jié)果顯示TGF-β1誘導(dǎo)AF細(xì)胞α

7、-SM actin表達上調(diào)(AF向MF轉(zhuǎn)化的標(biāo)志)的同時,也上調(diào)PDE1A表達,且呈劑量和時間依賴性。PDE1抑制劑IC86340預(yù)處理細(xì)胞后可以顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的α-.M actin的表達。TGF-β1可以時間依賴性上調(diào)PKCα的表達。PKC激動劑PMA可以濃度依賴性上調(diào)α-SM actin的表達。IC86340可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1對PKCα的上調(diào)作用。PKC抑制劑Calphostin C聯(lián)合PDE1抑制劑IC86340與單獨

8、應(yīng)用IC86340對TGF-β1誘導(dǎo)的α-SM actin的表達無差別。PDE1A在VAF膠原表達中的作用:TGF-β1可以時間依賴性上調(diào)Ⅰ型膠原的表達。PDE1抑制劑IC86340預(yù)處理細(xì)胞后可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原表達表達。PKC激動劑PMA濃度依賴性上調(diào)Ⅰ型膠原的表達。PKC抑制劑Calphostin C聯(lián)合IC86340進一步降低了Ⅰ型膠原的表達。
　　 [結(jié)論]
　　 在VAF中有14種PDE亞型mR