1、研究背景：
　　 血管重構(gòu)是多種心血管疾病(如冠心病、血管移植后狹窄、動脈粥樣硬化和高血壓等)的最終病理結(jié)局。既往研究者對于血管重構(gòu)的研究重點(diǎn)主要放在是血管的內(nèi)皮細(xì)胞和中膜的平滑肌細(xì)胞(VSMC)上，然而外膜細(xì)胞在血管重構(gòu)過程中的作用沒有受到重視。近年來，大量研究表明血管外膜在調(diào)控血管生理和病理方面同樣發(fā)揮著重要作用。研究顯示，在損傷和細(xì)胞因子等病理刺激下，作為血管外膜最主要的細(xì)胞成分，外膜成纖維細(xì)胞(adventital fi

2、broblast，AF)可通過激活、表型分化和腔內(nèi)遷移參與并促進(jìn)血管重構(gòu)。被激活的AF，增殖活性增強(qiáng)，并發(fā)生表型變化而分化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MF)，發(fā)生表型變化的特征是獲得α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)的表達(dá)。相對于AF，MF具有更強(qiáng)的增殖活性和分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的能力。MF的出現(xiàn)是組織器官對損傷進(jìn)行修復(fù)過程中的一個特征。血管外膜細(xì)胞的增殖和凋亡之間的平衡對于維

3、持血管正常生理功能起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)AF和MF的正常的細(xì)胞周期出現(xiàn)紊亂時，就會導(dǎo)致凋亡減少和過多的ECM沉積，最終導(dǎo)致病理性血管重構(gòu)。在這一病理過程中，會伴隨著一部分MF向血管腔內(nèi)遷移參與并促進(jìn)血管新生內(nèi)膜形成。血管新生內(nèi)膜形成是病理性血管重構(gòu)的一個重要病理特征。因此，血管外膜細(xì)胞(包括AF和MF)增殖和凋亡之間的平衡失控而導(dǎo)致的細(xì)胞過度增殖和凋亡抑制是血管重構(gòu)過程中的重要細(xì)胞事件。血管的AF和MF已成為抗血管重構(gòu)治療的兩個重要靶細(xì)

4、胞。
　　 microRNA(miRNA)代表了一種新的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。研究表明，miRNA參與了諸多重要的細(xì)胞生命活動過程，包括細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等。而異常的細(xì)胞增殖和凋亡在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的扮演著重要角色。正因為如此，目前關(guān)于miRNA的眾多研究集中在腫瘤方面。
　　 在近些年來已發(fā)現(xiàn)的諸多miRNA分子中，microRNA-21(miR-21)受到研究者更多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，miR21在許多腫瘤細(xì)胞中過表

5、達(dá)，并且是多種腫瘤組織中表達(dá)升高最明顯的miRNA分子之一，被稱作為“oncomir”，意思是具有致癌特性的miRNA分子，具有促增殖和抗凋亡作用。許多研究者認(rèn)為，對miR-21或其靶基因的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)或許會成為將來抗癌治療的有效措施。
　　 相對于腫瘤，miRNA在心血管方面的研究起步較晚。近年來，miR-21在心血管領(lǐng)域的功能也逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，僅次于腫瘤，在心血管疾病中miR-21的表達(dá)也明顯失調(diào)。在許多心血管疾病，

6、如血管球囊損傷、心臟肥厚和缺血性心臟病等，miR-21的表達(dá)異常。有研究顯示，大鼠頸動脈球囊損傷的血管壁中miR-21表達(dá)明顯升高；miR-21在VSMC中表達(dá)，并且能調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。有報道稱，miR-21在血管內(nèi)皮中也有表達(dá)，miR-21可以通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡而影響其生理功能。但是目前國內(nèi)外關(guān)于miRNA在血管外膜領(lǐng)域的研究報道很少，miR-21在血管AF和MF中是否表達(dá)以及是否對增殖和凋亡發(fā)揮調(diào)控功能尚不清楚。
　　

7、 研究顯示，血管增殖性疾病(如冠心病、動脈粥樣硬化等)和腫瘤在多種細(xì)胞事件和分子通路方面有著許多相似的特征。增殖和凋亡同是血管重構(gòu)過程和腫瘤的兩個重要的細(xì)胞生命活動，既然miRNA在腫瘤中發(fā)揮著重要作用，因此我們完全有理由相信，miRNA在血管重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展過程中同樣會發(fā)揮重要作用。
　　 近些年一些研究表明，以血管外膜細(xì)胞為靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)可以改善血管重構(gòu)。有研究顯示，17β-雌二醇可以通過抑制外膜細(xì)胞的增殖而減少球囊損傷后血

8、管新生內(nèi)膜的形成。也有研究報道，通過在血管外膜轉(zhuǎn)染smad7腺病毒使外膜細(xì)胞過表達(dá)Smad7，可以抑制TGF-β1通路，從而明顯減弱球囊損傷后成纖維細(xì)胞的促新生內(nèi)膜形成和血管重構(gòu)的作用。因此，以血管外膜細(xì)胞為靶點(diǎn)的血管外膜基因轉(zhuǎn)染代表了一種新的治療心血管疾病的方法。
　　 綜上所述，我們提出如下假說：miR-21在血管AF和MF中內(nèi)源性表達(dá)，并且miR-21在調(diào)控AF和MF的增殖和凋亡方面發(fā)揮著重要作用；通過干預(yù)miR-21的表

9、達(dá)能有效調(diào)控血管AF和MF的增殖和凋亡，并能進(jìn)一步改善由球囊損傷導(dǎo)致的血管重構(gòu)。
　　 目的：
　　 1.建立體外肌成纖維細(xì)胞模型，檢測并比較miR-21在成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)水平。
　　 2.通過調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平，研究miR-21對增殖和凋亡的影響。
　　 3.檢測能否通過干預(yù)miR-21的表達(dá)影響大鼠髂動脈球囊損傷所致的血管重構(gòu)。
　　 方法：

10、r>　　 1.成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)
　　 取4-6周(120-180克)雄性Wistar大鼠胸主動脈外膜，采用組織貼壁法原代培養(yǎng)外膜成纖維細(xì)胞。實(shí)驗用第3-6代細(xì)胞。
　　 2.細(xì)胞試驗分組
　　 (1)為確定TGF-β1誘導(dǎo)AF分化為MF的合適劑量和時間，行RT-PCR反應(yīng)，用TGF-β1(10 ng/ml)刺激不同的時間：0、6、12、24、36、48小時，分為6組；不同濃度的TGF-β1刺激24小時：0、1

11、、5、10、20、30 ng/ml，分為6組。行Western blot檢測，按照TGF-β1(10 ng/ml)刺激不同的時間：0、12、24、36小時，分為4組。
　　 (2)為檢測細(xì)胞內(nèi)miR-21的表達(dá)水平能否被調(diào)節(jié)，分為5組：空白對照組、抑制劑陰性對照組、miR-21抑制劑(即miR-2l inhibitor)組、前體陰性對照組和pre-miR-21(即miR-21前體)組。
　　 (3)為檢測細(xì)胞的增殖和凋亡

12、，根據(jù)干預(yù)措施不同分為5組：空白對照組、抑制劑陰性對照組、miR-21抑制劑組、前體陰性對照組和pre-miR-21組。
　　 3.建立肌成纖維細(xì)胞模型
　　 肌成纖維細(xì)胞由TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞而成，并經(jīng)RT-PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗方法鑒定。
　　 4.細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗
　　 將細(xì)胞玻片上生長的用(或未用)TGF-β1刺激的成纖維細(xì)胞，經(jīng)固定、0.5％Triton-X10

13、0處理、BSA封閉后，α-SMA和vimentin一抗過夜，用含有FITC和TRITC的二抗液孵育玻片，然后用DAPI染核，最后于熒光顯微鏡下觀察α-SMA和vimentin的表達(dá)情況。
　　 5.miRNA轉(zhuǎn)染
　　 體外培養(yǎng)的細(xì)胞用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染pre-miR-21或miR-21inhibitor分別造成miR-21的過表達(dá)或表達(dá)抑制，同時分別設(shè)陰性對照組。48小時后檢測細(xì)胞樣本。實(shí)驗

14、中用含F(xiàn)AM熒光標(biāo)簽的寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞以確定轉(zhuǎn)染效率。最終寡核苷酸的終濃度為50 nM。
　　 6.實(shí)時定量RT-PCR
　　 使用miRNA提取試劑盒提取用于檢測miR-21表達(dá)的細(xì)胞總RNA，用含有特異莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后TaqMan探針法在ABI7500 PCR儀上檢測miR-21的表達(dá)。用于檢測其他指標(biāo)(如α-SMA)的細(xì)胞總RNA的提取使用Trizol法，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用熒光實(shí)時定量的方法在B

15、io-Rad PCR儀上檢測。miR-21的相對表達(dá)用U6做內(nèi)參，α-SMA mRNA等的相對表達(dá)以β-actin為內(nèi)參，并用AACT的方法計算。
　　 7.蛋白印跡分析
　　 利用組織裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。等量的蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，膜封閉后，一抗過夜，用洗膜液清洗，用HRP結(jié)合的二抗孵育。ECL法發(fā)光，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表

16、達(dá)量。
　　 8.大鼠髂動脈球囊損傷模型的建立
　　 按照Gabeler報道的方法建立。Wistar大鼠(320-350 g)戊巴比妥麻醉，2 F的導(dǎo)管引入到右髂總動脈，球囊在3-4 atm壓力下來回拉動3次造成內(nèi)膜損傷。左側(cè)未損傷血管作為對照。
　　 9.血管外膜局部孵育寡核苷酸和動物實(shí)驗分組
　　 手術(shù)后在損傷血管的周圍均勻孵育20％(w/v)的F-127緩釋凝膠200μl，凝膠中含有0.24 mg

17、miR-21 antagomir(用于體內(nèi)實(shí)驗的miR-21的特異抑制劑)或等體積的PBS。實(shí)驗動物分為3組：miR-21 antagomir組(凝膠中含有miR-21antagomir，n=15)、損傷組(凝膠中僅含有PBS，n=20)和未損傷組(左側(cè)未損傷血管，n=20)。損傷組于手術(shù)后1天、3天和21天處死，miR-21 antagomir組于手術(shù)后3天和21天處死，分別用于進(jìn)行增殖檢測(術(shù)后3天，n=5)、凋亡檢測(術(shù)后1天和3

18、天，n=5)和HE染色(術(shù)后21天，n=5)。
　　 10.細(xì)胞增殖檢測
　　 細(xì)胞轉(zhuǎn)染pre-miR-21或miR-21 inhibitor后48小時，采用EdU的方法檢測細(xì)胞的增殖率。操作按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒的說明書進(jìn)行，增殖的細(xì)胞EdU染核陽性，用Hoechst33342染細(xì)胞核，熒光鏡下觀察高倍視野下細(xì)胞EdU陽性數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的比例，計算細(xì)胞增殖率。
　　 動物實(shí)驗中，采用BrdU方法檢測細(xì)胞增殖

19、。分別在動物處死前12和24小時各注射BrdU一次。按照說明書操作，使用特異的BrdU抗體檢測組織細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率按高倍視野中BrdU陽性數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比計算。
　　 11.細(xì)胞凋亡檢測
　　 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時分別采用Annexin-V/7-AAD雙染的方法和Caspase-3活性檢測的方法檢測細(xì)胞的凋亡情況。Annexin-V/7-AAD雙染利用流式細(xì)胞儀(FACS)進(jìn)行檢測。Caspase-3活性檢測采

20、用比色法檢測Caspase-3相對活性。
　　 在動物實(shí)驗中，按照試劑盒說明，采用TUNEL方法檢測細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的凋亡率按高倍視野中TUNEL陽性數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比計算。
　　 12.免疫組織化學(xué)
　　 為檢測血管外膜成纖維細(xì)胞的分化，取石蠟切片，按照SABC免疫組織試劑盒的操作說明，行免疫組織化學(xué)檢測α-SMA的表達(dá)。
　　 13.形態(tài)測定分析
　　 通過測定血管組織形態(tài)學(xué)的改變來分析血管重

21、構(gòu)的情況。用HE染色法，對新生內(nèi)膜/中膜面積(Neointimal/Medial area，N/M)和管腔大小(LUmen Size)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，用IPP軟件進(jìn)行測量。
　　 14.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤計算，來源于3次以上獨(dú)立實(shí)驗。兩組間的差異用t檢驗，多組間的差異用單因素方差分析。數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0軟件分析，P<0.05代表有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　

22、 1.體外用TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞
　　 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，在蛋白和mRNA水平上，TGF-β1都能顯著促進(jìn)α-SMA的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴性：TGF-β1(10 ng/ml，24小時)能明顯促進(jìn)α-SMA的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗研究顯示，經(jīng)TGF-β1(10 ng/ml，24小時)處理后，細(xì)胞共表達(dá)vimentin和α-SMA，同時胞漿內(nèi)形成大量肌絲，表明AF分化

23、為MF，體外建立肌成纖維細(xì)胞模型成功。
　　 2.miR-21在AF中內(nèi)源性表達(dá)并且在MF中表達(dá)升高
　　 實(shí)時定量RT-PCR(探針法)檢測發(fā)現(xiàn)，AF中內(nèi)源性表達(dá)miR-21。相對于AF，MF中miR-21的表達(dá)水平明顯升高。
　　 3.調(diào)節(jié)miR-21在AF和MF中的表達(dá)
　　 為檢測AF和MF中miR-21的表達(dá)水平能否被調(diào)節(jié)，我們采用了表達(dá)抑制和過表達(dá)的方法。在AF和MF中，轉(zhuǎn)染pre-miR-2

24、1后，miR-21的表達(dá)水平明顯升高：轉(zhuǎn)染miR-21抑制劑(miR-21 inhibitor)后，miR-21的表達(dá)明顯下降，然而轉(zhuǎn)染對照核苷酸后miR-21的表達(dá)量沒有明顯變化，說明miR-21在AF和MF中的表達(dá)水平是可以調(diào)節(jié)的。
　　 4.miR-21對AF和MF增殖的作用
　　 EdU增殖檢測分析結(jié)果顯示，在AF和MF中，抑制miR-21的表達(dá)后，兩種細(xì)胞的EdU摻入率減少；轉(zhuǎn)染pre-miR-21使細(xì)胞過表達(dá)

25、miR-21后，AF和MF的EdU摻入率減少增加；上述結(jié)果表明，miR-21具有促進(jìn)AF和MF的增殖活性的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，無論在基礎(chǔ)水平還是經(jīng)pre-miR-21干預(yù)之后，MF較AF都顯示出更高的增殖活性。
　　 5.miR-21對AF和MF凋亡的作用
　　 Annexin-V/7AAD流式細(xì)胞術(shù)和Caspase-3活性檢測結(jié)果顯示，AF和MF轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor抑制miR-21表達(dá)后，annexin

26、V陽性細(xì)胞數(shù)和Caspase-3的活性都明顯增加；而過表達(dá)miR-21后則出現(xiàn)相反的結(jié)果，說明在AF和MF中，miR-21發(fā)揮了為抗凋亡的作用。
　　 6.miR-21抑制劑對球囊損傷的血管的外膜成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡的影響
　　 免疫組化結(jié)果顯示，在球囊損傷術(shù)后3天，血管外膜中可見α-SMA陽性細(xì)胞，這一結(jié)果提示已有部分AF分化為MF。
　　 術(shù)后3天，損傷組的血管外膜細(xì)胞增殖活性較未損傷組明顯升高；而相對于損

27、傷組，miR-21 antagomir組的血管外膜細(xì)胞增殖率明顯下降。
　　 TUNEL結(jié)果顯示，未損傷的血管外膜凋亡細(xì)胞很少；術(shù)后1天，損傷組的外膜可見較多凋亡細(xì)胞；術(shù)后3天，損傷組外膜中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降，與未損傷組無明顯差別；然而，miR-21 antagomir(miR-21抑制劑)組相較于未拉傷組和損傷組(術(shù)后3天)，凋亡率明顯升高。
　　 7.miR-21抑制劑對球囊所致的血管重構(gòu)的影響
　　 為了檢

28、測miR-21抑制劑對球囊損傷所致的血管重構(gòu)的影響，我們對球囊損傷后21天的血管進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的分析。相對于未損傷組，損傷組的血管呈現(xiàn)出明顯的新生內(nèi)膜形成和管腔的損失；相對于損傷組，miR-21 antagomir組的內(nèi)膜/中膜面積比(N/M)明顯降低，并且管腔損失程度得到改善。
　　 結(jié)論：
　　 1.miR-21在血管成纖維細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)，并且在TGF-β1誘導(dǎo)而成的肌成纖維細(xì)胞中miR-21表達(dá)明顯升高。