1、第一部分移植物血管外膜平滑肌祖細胞的分離、鑒定及誘導分化
　　目的：為了確定移植物血管病變內(nèi)膜平滑肌樣細胞來源，并了解其生物學特性。
　　方法：將C57BL/6背景的eGFP轉(zhuǎn)基因鼠與野生型C57BL/6進行交叉骨髓移植后作為主動脈移植的受體，然后將BALB/C供體小鼠的胸主動脈移植入受體腹主動脈之間。移植術后于1、2、4、6、8、10周等不同時間點取出移植血管進行免疫熒光檢測。使用流式分選技術將移植物血管中內(nèi)膜或外膜的eG

2、FP陽性細胞分選出來在體外培養(yǎng)，并誘導分化，通過免疫熒光技術鑒定其分子標志等。將體外培養(yǎng)純化的帶有eGFP熒光標記的平滑肌祖細胞包裹在普通野生型C57BL/6移植血管周圍，了解其能否遷移入血管內(nèi)膜。
　　結(jié)果：骨髓來源的單核細胞在術后兩周在內(nèi)膜中達到高峰，隨后逐漸下降，但并不能表達平滑肌標志物SM-MHC，可表達CD68等單核/巨噬細胞標志。而在術后兩周移植血管外膜中開始出現(xiàn)一群非骨髓來源的細胞，可表達干細胞標志Sca-1及早期平

3、滑肌分化標志SM-22α等，但不能表達SM-MHC。該群細胞可遷移進入血管內(nèi)膜逐漸表達SM-MHC，并成為增生內(nèi)膜的主要細胞。通過流式分選技術從血管外膜將該群細胞分選后并在體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)在體外經(jīng)過PDGF-BB或TGF-β誘導可表達SM-MHC。再體外培養(yǎng)純化的平滑肌祖細胞可從外膜遷移入內(nèi)膜并加重移植物血管病變的內(nèi)膜增生。
　　結(jié)論：移植后受體的中非骨髓細胞來源的平滑肌祖細胞可遷移入血管內(nèi)膜并分化為表達SM-MHC的平滑肌樣細胞，從

4、而促進內(nèi)膜增生病變。
　　第二部分 miR-155可調(diào)控單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)濃度梯度誘導外膜血管平滑肌祖細胞向內(nèi)膜定向遷移
　　目的：了解miR-155在移植物血管病變中的作用以及對骨髓來源的單核細胞和平滑肌祖細胞的功能影響。
　　方法：將C57BL/6背景的miR-155基因敲除鼠和野生型C57BL/6小鼠進行交叉骨髓移植后再作為主動脈移植的受體。流式細胞儀分選出移植物血管中骨髓來源的單核細胞，使用RT

5、-PCR方法測定各種趨化因子的變化水平，并轉(zhuǎn)染miR-155mimics和inhibitor后使用ELISA測定培養(yǎng)上清細胞因子變化情況。使用RT-PCR方法測定移植血管標本內(nèi)膜外膜間趨化因子濃度梯度水平，并通過Transwell實驗測定在骨髓來源的單核細胞對平滑肌祖細胞遷移能力的誘導作用及機制。
　　結(jié)果：術后八周我們發(fā)現(xiàn)接受了miR-155敲除鼠骨髓細胞的小鼠內(nèi)膜增生病變最輕，而即使是miR-155敲除鼠接受了miR-155+

6、/+骨髓細胞小鼠也發(fā)生明顯內(nèi)膜增生。miR-155可通過抑制骨髓來源單核細胞B細胞淋巴瘤因子6的表達而促進單核細胞趨化因子-1（MCP-1）的表達從而誘導平滑肌祖細胞的發(fā)生定向遷移。當骨髓來源的單核細胞中miR-155被敲除后在移植血管內(nèi)膜外膜間MCP-1濃度梯度大幅度降低以至于難以形成有效的濃度梯度。
　　結(jié)論：miR-155可通過調(diào)控骨髓來源單核細胞功能分泌MCP-1而改變內(nèi)膜外膜之間濃度梯度，促進平滑肌祖細胞向內(nèi)膜遷移。

7、r>　　第三部分 TGF-βI型受體磷酸激酶抑制劑（SD-208）可抑制平滑肌祖細胞的增殖和遷移能力
　　目的：評價TGF-βI型受體磷酸化酶抑制劑（SD-208）能否抑制內(nèi)膜平滑肌樣細胞的增殖及遷移能力而減輕移植物血管病變。
　　方法：BALB/c小鼠主動脈移植到 C57BL/6小鼠腹主動脈，術后每天給予40或60 mg/kg的SD-208灌胃，術后1、2、4、6、8周取出移植血管分析內(nèi)膜增生程度并通過免疫組化方法分析TG

8、F-β/Smad3通路各蛋白表達情況。體外培養(yǎng)中層平滑肌細胞及內(nèi)膜平滑肌樣細胞使用TGF-βand SD-208對于兩種細胞進行干預，了解增殖、遷移能力的異同。
　　結(jié)果：在給予40及60 mg/kg等不同劑量的SD-208治療后，移植血管的內(nèi)膜增生程度分別比對照組下降了32％和48%。SD-208可以抑制TGF-β對于內(nèi)膜平滑肌樣細胞增殖和遷移能力的促進作用而對于其對于中層平滑肌細胞的抑制作用并沒有明顯影響。SD-208可明顯減