1、肝部分切除術(shù)(Partial Hepatectomy，PH)是目前治療各種肝臟良惡性疾病最有效方法之一。但擴(kuò)大性肝切除術(shù)后易出現(xiàn)致命性肝功能衰竭，其治療仍是世界性難題。雖然肝移植是有效治療途徑，但供體嚴(yán)重不足限制其廣泛開(kāi)展；現(xiàn)有生物人工肝技術(shù)仍不能完全替代肝臟功能；肝細(xì)胞移植體內(nèi)后增殖有限，也限制其治療效果。肝臟與其它器官不同，具有巨大的潛在再生能力，肝切除術(shù)后殘肝主要通過(guò)成熟的肝細(xì)胞復(fù)制增殖實(shí)現(xiàn)再生。但目前對(duì)其自身調(diào)控機(jī)制研究極少，僅

2、有少量文獻(xiàn)報(bào)告TGF-β表現(xiàn)為負(fù)向調(diào)控肝細(xì)胞增殖。因此，探索肝細(xì)胞再生分子機(jī)制具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義，從而為臨床促進(jìn)肝再生、防治肝功能衰竭奠定理論基礎(chǔ)。
　　 我們前期國(guó)家自然科學(xué)基金課題研究顯示，Tmubl蛋白在肝細(xì)胞增殖周期中對(duì)其增殖進(jìn)程發(fā)揮了重要的自身調(diào)控作用。Tmubl于2005年首次報(bào)道，包含245個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)主要有1個(gè)類(lèi)似泛素結(jié)構(gòu)的區(qū)域(UBL；121-175aa)，包含了與UCH、E2和CUE的反應(yīng)位點(diǎn)。目前對(duì)

3、Tmubl基因及其蛋白研究結(jié)果：Tmubl蛋白為一種穿梭蛋白。過(guò)表達(dá)Tmubl可顯著抑制大鼠H-35肝癌細(xì)胞增殖；Tmubl沉默后導(dǎo)致異常中心體、多核細(xì)胞出現(xiàn)以及異常紡錘體形成。這些研究結(jié)果均表明Tmubl基因及其蛋白產(chǎn)物在肝再生細(xì)胞增殖周期中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，但其具體的機(jī)制還不十分明確。
　　 目前體外肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染已有許多報(bào)道，技術(shù)趨于成熟，而體內(nèi)肝臟基因轉(zhuǎn)染方法不一，有通過(guò)小鼠尾靜脈注射的，但常需注射大量的病毒質(zhì)粒，超

4、過(guò)小鼠生理負(fù)荷量，甚至致死，而且轉(zhuǎn)染效率低：較普遍通過(guò)大鼠門(mén)靜脈注射法，可以減少病毒注射量，轉(zhuǎn)染效率明顯好于尾靜脈注射，但門(mén)靜脈位置深，易出血致實(shí)驗(yàn)失敗，而且通過(guò)門(mén)靜脈注射引起入肝血流量的變化，肝竇壓力改變，可導(dǎo)致肝竇狀細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，改變了肝臟原有內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致潛在實(shí)驗(yàn)性干擾。如何優(yōu)化體內(nèi)肝臟基因轉(zhuǎn)染途徑以進(jìn)一步完善肝臟的研究方法及其臨床運(yùn)用，這些問(wèn)題還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的：
　　 1、探討肝臟基因轉(zhuǎn)染大鼠體內(nèi)動(dòng)

5、物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)對(duì)比探討一種既操作方便、對(duì)大鼠刺激反應(yīng)較小，又具有較高基因轉(zhuǎn)染率的大鼠肝內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方法。
　　 2、通過(guò)沉默Tmubl基因，觀察大鼠肝切除術(shù)后肝細(xì)胞增殖周期進(jìn)程的變化及Tmubl蛋白對(duì)肝再生的影響。
　　 3、初步探討Tmubl蛋白對(duì)肝細(xì)胞增殖周期調(diào)控機(jī)制，分析可能相關(guān)的調(diào)控蛋白及作用機(jī)制。
　　 研究?jī)?nèi)容及方法：
　　 1.大鼠肝臟Tmubl RNAi慢病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染及效果檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)研究<

6、br>　　 1.1大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組。大鼠的盲腸靜脈粗大，位置表淺，易于尋找，操作簡(jiǎn)單，周?chē)胸S富的脂肪組織，并且盲腸靜脈屬于門(mén)靜脈的屬支，因此，將大鼠分為盲腸靜脈組、門(mén)靜脈組、尾靜脈組及對(duì)照組，分別注射攜帶綠色熒光蛋白(GFP)重組Tmubl RNAi慢病毒。
　　 1.2在肝內(nèi)基因轉(zhuǎn)染后第二天行肝臟組織冰凍切片，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察各組GFP表達(dá)情況，比較各組轉(zhuǎn)染率。
　　 1.3評(píng)估經(jīng)門(mén)靜脈和盲腸靜脈注射對(duì)門(mén)

7、靜脈壓力的影響。設(shè)盲腸靜脈和門(mén)靜脈注射組各3只大鼠，用PowerLab/8sp數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(ADinstruments，AU)檢測(cè)在注射時(shí)門(mén)靜脈壓力的變化情況，以此比較兩者注射方式對(duì)門(mén)靜脈壓力的影響。
　　 1.4檢測(cè)三種注射方法對(duì)大鼠肝功及機(jī)體刺激反應(yīng)的影響。在注射后第二天同時(shí)取5 ml非抗凝門(mén)靜脈血，ELISA試劑盒(eBioscience，San Diego，CA)檢測(cè)每份標(biāo)本的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotra

8、nsferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、腫瘤壞死因子-a(Tumor Necrosis Factor-a，TNF-a)和白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)的值，每份標(biāo)本至少檢測(cè)3次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 2、研究Tmubl沉默對(duì)肝切除術(shù)后肝再生細(xì)胞增殖周期影響
　　 2.1大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分組。在體內(nèi)肝臟成功轉(zhuǎn)染后，復(fù)制經(jīng)典的70%大鼠肝切除術(shù)動(dòng)物

9、模型，于PH術(shù)后第2天提取原代肝細(xì)胞及肝組織作為標(biāo)本，研究Tmubl沉默對(duì)肝切除術(shù)后肝再生細(xì)胞增殖周期影響。將36只大鼠隨機(jī)分三組，即Tmubl RNAi實(shí)驗(yàn)組，慢病毒空載體組，對(duì)照組，每組均分別取PH術(shù)后0h、2h、12h、24h共4個(gè)時(shí)相點(diǎn)各3只大鼠。
　　 2.2運(yùn)用RT-PCR法及Western Blot法分別檢測(cè)提取的肝細(xì)胞樣本中的Tmubl基因及securin基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)情況，其中對(duì)Tmubl的檢測(cè)反

10、映RNAi慢病毒干擾效果及Tmubl沉默效果，對(duì)securin的檢測(cè)反映Tmubl沉默后對(duì)其基因水平及蛋白水平的影響。
　　 2.3用噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組肝細(xì)胞增殖情況。將各組肝部分切除術(shù)后提取的細(xì)胞收集到含血清的培養(yǎng)基中，將細(xì)胞稀釋至25×103個(gè)/ml，加入MTT試劑溫育3h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，繪制曲線圖。
　　 2.4流式細(xì)胞儀觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期情況。將各實(shí)驗(yàn)組提取細(xì)胞的細(xì)胞固定，半個(gè)小時(shí)左右行流式細(xì)胞

11、儀檢測(cè)，及時(shí)分析數(shù)據(jù)結(jié)果。
　　 2.5 Immunoprecipitation法及蛋白質(zhì)譜分析檢測(cè)Tmubl蛋白與securin相互作用。在收獲的細(xì)胞中加入適量細(xì)胞IP裂解緩沖液提取蛋白，將10-50μl securin抗體加入到細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀，并行Western blotting電泳分析及蛋白質(zhì)譜分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠肝臟Tmubl RNAi慢病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染及效果檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)研究
　　

12、 1.1大鼠體內(nèi)肝臟慢病毒注射操作情況。統(tǒng)計(jì)三組平均注射操作時(shí)間，經(jīng)門(mén)靜脈注射最復(fù)雜、耗時(shí)，尾靜脈注射最方便，而經(jīng)盲腸靜脈平均注射時(shí)間約8-17分鐘。三組實(shí)驗(yàn)操作成功率方面，經(jīng)盲腸靜脈及尾靜脈注射全部成功，而經(jīng)門(mén)靜脈注射組有3只大鼠死亡，其死亡原因均為腹腔內(nèi)出血，盲腸靜脈周?chē)胸S富的脂肪組織，注射后壓迫10秒后即可止血。
　　 1.2激光共聚焦顯微鏡觀察肝臟冰凍切片的GFP表達(dá)情況，盲腸靜脈組與門(mén)靜脈組均可明顯觀察到較強(qiáng)綠色熒

13、光，兩組轉(zhuǎn)染效果基本一致，并且綠色熒光表達(dá)在肝細(xì)胞索上，尾靜脈注射組僅觀察到散在熒光，轉(zhuǎn)染率較低，在對(duì)照組的大鼠肝臟切片中均未見(jiàn)綠色熒光。
　　 1.3測(cè)壓實(shí)驗(yàn)中，門(mén)靜脈注射明顯增加門(mén)靜脈壓力，而經(jīng)盲腸靜脈注射對(duì)門(mén)靜脈的影響較小，在注射操作時(shí)僅引起瞬間波動(dòng)，但很快就能恢復(fù)至正常水平。
　　 1.4血清肝轉(zhuǎn)氨酶、IL-6和TNF-a的ELISA結(jié)果。盲腸靜脈組血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT182.0±29.9 IU/L，AST114.

14、4±17.5 IU/L)及IL-6和TNF-a值(IL-6244.5±48.4 pg/ml，TNF-a137.4±81.8 pg/ml)明顯低于門(mén)靜脈組和尾靜脈組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=20，P<0.001)，盲腸靜脈注射方式明顯減輕對(duì)肝功及機(jī)體的應(yīng)急刺激反應(yīng)的影響。
　　 2.研究Tmubl沉默對(duì)肝切除術(shù)后肝再生細(xì)胞增殖周期影響
　　 2.1.Tmubl RNAi干擾效果檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組Tmubl mRNA和蛋白表達(dá)均被

15、有效抑制(p<0.05)，結(jié)果與激光共聚焦結(jié)果基本一致。
　　 2.2 MTT實(shí)驗(yàn)顯示，Tmubl RNAi實(shí)驗(yàn)組明顯上調(diào)PH術(shù)后6h-24h肝細(xì)胞的增殖速率。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Tmubl沉默組肝細(xì)胞增殖的G2/M期占11.07%，高于對(duì)照組2.68%，兩組細(xì)胞比例數(shù)具有明顯差別。Tmubl沉默后，PH術(shù)后肝細(xì)胞增殖加速，主要集中在G2/M期細(xì)胞。說(shuō)明Tmubl蛋白下調(diào)了G2/M期肝細(xì)胞的增殖速率。
　　 2.3

16、RT-PCR及Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tmubl沉默后，對(duì)securin mRNA無(wú)影響，但實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞中securin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。這說(shuō)明Tmubl對(duì)securin在基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯影響，而主要作用于蛋白水平，進(jìn)一步證明了Tmubl蛋白與securin降解間存在某種關(guān)系。
　　 2.4 IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Tmubl蛋白和securin能在肝細(xì)胞中發(fā)生結(jié)合，同時(shí)，進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析明確Tmubl蛋白和s

17、ecurin能在肝細(xì)胞中發(fā)生結(jié)合，并且兩蛋白間產(chǎn)生了相互作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、通過(guò)大鼠的盲腸靜脈注射行肝內(nèi)基因轉(zhuǎn)染，這種方式對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)激刺激小，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，并且可獲得較好的轉(zhuǎn)染效果，是一種便捷、安全的肝內(nèi)基因轉(zhuǎn)染途徑。
　　 2、重組慢病毒載體可攜帶目前基因干擾片片段和GFP探針用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，并且能較好發(fā)揮較好的基因干擾效果。
　　 3、Tmubl沉默后導(dǎo)致肝細(xì)胞G2/M期增殖速率明顯