1、目的：在人類基因組中，有98％的DNA序列屬于非編碼序列。非編碼序列中大約有一半的序列屬于重復序列，主要的重復序列類型有長散在核元件(long interspersed nuclearelements，LINEs)、短散在核元件(short interspersed nuclearelements，SINEs)和長末段重復序列(long terminal repeat，LTR)等，其中的LINEs包括LINE1(L1)和LINE2(L2

2、)，SINEs主要包括Alu家族(Alu family)。L1重復序列和Alu分別占據(jù)了人類基因組的16.9％和9.9％，兩者是人類基因組中最主要的重復序列。L1序列中蘊藏著重要的遺傳和分化信息，在容易失活的基因、等位排斥基因及其側(cè)翼存在較多的L1序列，比如免疫細胞的B細胞受體基因，T細胞受體基因，細胞因子中的白介素2基因等。另外L1與基因表達調(diào)節(jié)，腫瘤發(fā)生，個體發(fā)育，生物進化等有關。 Alu家族是一組廣泛分布的，300bp大小

3、的重復序列，在人類單倍體基因組中約有100萬個Alu(包括不完整的重復序列)，是含量次多的重復序列。Alu與多種生物學現(xiàn)象有關，包括腫瘤發(fā)生，染色體重組，翻譯調(diào)節(jié)。研究表明，Alu與免疫系統(tǒng)也具有密切相關性。Alu序列可能被一些正向的順式調(diào)節(jié)元件所識別，比如人類的CD8 α基因T細胞特異性的增強子。Hambor等研究證實CD8 α基因中最后一個內(nèi)含子中的Alu插入片段起到增強子作用。已知L1有l(wèi)O個家族(L1M4，L1M3，L1M2，L

4、1M1，L1P5，L1P4，LIP3，LIP2，L1P1和Hs)。根據(jù)其開放閱讀框2(openedreading frame2.ORF2)和3'非翻譯區(qū)同源性進行分類，這10個家族又可以分為75種亞類(亞家族)，Hart等發(fā)現(xiàn)將L1ORF2(來自于L1家族中的L1.2亞家族)插入報告基因下游可以下調(diào)EGFP(Enhanced green fluorescent protein，增強性綠色熒光蛋白，簡稱GFP)表達，那么其他家族成員是否也

5、有類似表現(xiàn)還尚且不明，而且GFP基因為何會受到下游插入L1.2序列的影響目前也仍屬未知。本文中我們將來自另外一個亞家族成員L1PA3的ORF2按不同方向以及14個Alu重復序列串聯(lián)裝入pEGFP-C1質(zhì)粒中(分別簡稱p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14)，瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，鏡下觀察GFP熒光陽性細胞的比例，以研究不同種類的重復序列對GFP報告基因表達的影響。 考慮到其抑制作用可能存在多種機制，為了更好的了解非編碼重

6、復序列對基因表達調(diào)節(jié)的分子作用機理，我們在構(gòu)建好的質(zhì)?；A上插入猴巨細胞病毒早期蛋白多聚腺苷酸加尾信號(simian virus40 polyadenylation signal，SV40PolyA，簡稱PolyA)正、反序列(240bp)以觀察PolyA及PolyAas對p-ORF2、p-ORF2as、p-Alu14中GFP熒光報告基因的影響。 方法： 1 構(gòu)建p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14重組質(zhì)粒PC

7、R擴增RP11克隆上L1PA3的ORF2，在引物設計合適的限制性核酸內(nèi)切酶切位點。經(jīng)酶切后將PCR擴增產(chǎn)物ORF2、ORF2as分別裝入pEGFP-Cl質(zhì)粒GFP下游MCS(p-ORF2，p-ORF2as)。PCR擴增RP11克隆上的Alu，在引物設計合適的酶切位點，根據(jù)Xba Ⅰ和NheⅠ酶切位點可以連接不能切斷的特性，反復串聯(lián)構(gòu)建出含有14個Alu的表達載體(p-Alu14)。 2 構(gòu)建插入polyA正、反序列的重組質(zhì)粒PC

8、R擴增pEGFP-Cl質(zhì)粒的PolyA，在上、下游引物設計合適的酶切位點，在P-ORF2，P-ORF2as，p-Alu14質(zhì)粒中的GFP基因下游按正、反方向插入PolyA，分別命名為P-A-ORF2，p-A-ORF2as，p-A-Alu14，P-Aas-ORF2，p-Aas-ORF2as，p-Aas-Alu14。 3 細胞轉(zhuǎn)染和熒光觀察將構(gòu)建好的質(zhì)粒用Lipofectamine<'TM>2000瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，以轉(zhuǎn)染空載體

9、pEGFP-Cl和未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞做為對照，熒光顯微鏡下計數(shù)觀察GFP熒光陽性細胞數(shù)，白光下計數(shù)同樣視野的細胞總數(shù)(每個樣本至少500個)，計算熒光陽性細胞百分率。在白光和熒光下分別對同一視野照相。 結(jié)果： 1 插入序列均不同程度抑制GFP熒光將P-ORF2，P-ORF2as，P-Alu14三個質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，24小時后觀察熒光細胞陽性率。通過熒光計數(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，P-ORF2(0.47±0.10)％，P-OR

10、F2as(3.72±0.58)％，P-Alul4(0.03±0.05)％三者熒光表達率均明顯低于pEGFP-Cl質(zhì)粒熒光表達率(35.93±1.81)％。在GFP下游插入不同序列對熒光抑制程度不同：Alu14抑制作用最強，ORF2次之，ORF2as最弱。未轉(zhuǎn)染的HeLa無熒光表達。 2 PolyA正、反序均可以上調(diào)受抑制的GFP基因當p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14三個質(zhì)粒的GFP下游插入正序PolyA后瞬時轉(zhuǎn)染H

11、eLa細胞24h后觀察熒光細胞，計數(shù)并計算熒光細胞百分數(shù)。三種質(zhì)粒熒光表達率分別為：p-A-ORF2(7.69±0.55)％，P-A-ORF2as(11.2±1.14)％，p-A-Alul4(3.94+0.26)％。均高于對應的未插入PolyA的p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14。 當p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14三個質(zhì)粒的GFP下游插入反序PolyA后瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞24h后觀察熒光細胞，計數(shù)并

12、計算熒光細胞百分數(shù)。三種質(zhì)粒熒光表達率分別為：p-Aas-ORF2(9.15±0.77)％，p-Aas-ORF2as(15.24±0.88)％，p-Aa--Alu14(5.67±0.59)％。均高于對應的未插入PolyAas的p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14。 結(jié)論： 1 在GFP基因下游插入長度相同的LIORF2，ORF2as，Alu14后，與pEGFP-Cl相比較，三者均下調(diào)GFP的表達。 2