1、正常聽力對(duì)于我們交流和認(rèn)知非常重要。聽力的缺陷深深的影響到社會(huì)生活的方方面面。耳蝸螺旋神經(jīng)元是聽覺通路的初級(jí)傳入神經(jīng)元，它將聲音信息轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)沖動(dòng)并向聽覺中樞傳導(dǎo)。在哺乳動(dòng)物，螺旋神經(jīng)元一旦損傷即不可再生或修復(fù)。目前，耳蝸移植干細(xì)胞替代受損或缺失的毛細(xì)胞和或螺旋神經(jīng)元治療由此引起的感音神經(jīng)性耳聾已成為耳科學(xué)研究方面的重點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。
　　為了順利把細(xì)胞移植入耳蝸，研究者采用了各種不同的手術(shù)方法和路徑，盡可能把移植細(xì)胞送到距離損傷部

2、位較近的位置或者直接送到損傷部位。例如：通過圓窗、鼓階、半規(guī)管把細(xì)胞送到外淋巴液系統(tǒng)；也有學(xué)者把細(xì)胞經(jīng)中階直接注入內(nèi)淋巴液系統(tǒng)或通過基底膜上鉆孔把細(xì)胞輸送到中階；還有人試圖通過聽神經(jīng)中樞端移植入干細(xì)胞。
　　外源性干細(xì)胞移植后的狀態(tài)，不僅受移植細(xì)胞類型、分化狀態(tài)、種屬來源的影響，還受宿主組織器官狀態(tài)影響，研究表明，受損器官或組織更利于移植細(xì)胞的存活。因此，選擇合適的移植細(xì)胞類型和受體動(dòng)物模型，對(duì)研究耳蝸移植干細(xì)胞存活、增殖、分化和

3、功能重建具有重要意義。同時(shí)，研究病理狀態(tài)下?lián)p傷微環(huán)境中有關(guān)細(xì)胞趨化、增殖、分化的分子表達(dá)變化，對(duì)于我們更好的了解細(xì)胞替代治療的機(jī)制和機(jī)理也很有幫助。
　　本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇具有嗜神經(jīng)元毒性的毒毛旋花子甙誘導(dǎo)耳蝸螺旋神經(jīng)元損傷模型，試圖建立單純的螺旋神經(jīng)元凋亡，為后續(xù)試驗(yàn)打下基礎(chǔ)；鑒于耳蝸來源于外胚層，我們通過同樣是感覺上皮細(xì)胞的嗅球組織來源干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，為了提高其干細(xì)胞特性，我們使用胚胎14.5天小鼠嗅球提取、分離干細(xì)胞；為

4、了更好的觀察移植細(xì)胞，我們選擇C57BL/6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠作為細(xì)胞種屬來源；實(shí)驗(yàn)中，我們探索了各種手術(shù)徑路，我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，移植到耳蝸外側(cè)壁的細(xì)胞具有向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移的趨勢(shì)，于是我們?cè)O(shè)計(jì)了耳蝸外側(cè)壁移植細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，通過觀察干細(xì)胞在耳蝸的分布來驗(yàn)證該徑路是否可行，同時(shí)我們?cè)谝浦参稽c(diǎn)注射示蹤劑，來驗(yàn)證其可靠程度，我們?cè)O(shè)了假手術(shù)對(duì)照組，來驗(yàn)證該手術(shù)方法對(duì)耳蝸功能的影響。最后，我們觀察了損傷微環(huán)境，CXCL12蛋白表達(dá)變化，探討CXCL12

5、/CXCR4信號(hào)通路是否參與耳蝸移植干細(xì)胞的遷移和在耳蝸分布的調(diào)節(jié)。
　　實(shí)驗(yàn)一：SD大鼠耳蝸SGNs損傷模型
　　目的：獲得單純螺旋神經(jīng)元損傷動(dòng)物模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：選用16只成年大鼠，8只圓窗龕給藥，8只給生理鹽水作為對(duì)照，手術(shù)打開聽泡，暴露圓窗龕，10μl10mM毒毛旋花子甙生理鹽水溶液圓窗龕給藥，觀察給藥后ABR閾值變化，耳蝸切片觀察螺旋神經(jīng)元密度改變，毛細(xì)胞鋪片觀察毛細(xì)胞情況
　　結(jié)果

6、：HE染色顯示與正常耳蝸組織切片相比，給藥3天，螺旋神經(jīng)元顯著減少，給藥7天后，神經(jīng)元及其他細(xì)胞進(jìn)一步減少，神經(jīng)節(jié)區(qū)域呈現(xiàn)一片“荒漠樣”改變；tubulin染色陽性細(xì)胞（神經(jīng)元細(xì)胞）在給藥3天后，細(xì)胞數(shù)量大幅減少，神經(jīng)纖維無明顯改變；7天后陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少，基底膜鋪片結(jié)果顯示手術(shù)后7天，手術(shù)組及手術(shù)給藥組均未見明顯內(nèi)外毛細(xì)胞及纖毛的缺失，ABR閾值檢測(cè)顯示手術(shù)給藥物組ABR閾值顯著升高，單純手術(shù)組閾值升高不明顯。
　　結(jié)論：本

7、實(shí)驗(yàn)成功建立了穩(wěn)定、可靠的單純螺旋神經(jīng)元損傷模型，該模型對(duì)內(nèi)耳其他組織和細(xì)胞無明顯傷害，為研究螺旋神經(jīng)元損傷和修復(fù)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)二：嗅球神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)
　　目的：獲得GFP+嗅球神經(jīng)干細(xì)胞，并對(duì)其干細(xì)胞特性及向神經(jīng)元分化能力進(jìn)行了鑒定，為耳蝸細(xì)胞移植奠定了基礎(chǔ)。
　　方法：C57BL/6-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠2只，孕14.5天，取胎鼠8—-10只手術(shù)獲得繡球組織，分離后干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，4-5天傳代一次，免

8、疫熒光方法鑒定其是否為神經(jīng)干細(xì)胞，體外向神經(jīng)元方向分化能力。
　　結(jié)果：取自胚胎第14.5天C57BL/6-GFP嗅球組織的干細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮的綠色熒光。細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，并形成大小不等的神經(jīng)球，隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，細(xì)胞球體積逐漸增大、折光性好，形態(tài)飽滿，說明細(xì)胞活性良好。細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，每4-5天即需傳代，以保持適當(dāng)細(xì)胞密度。細(xì)胞雖經(jīng)多次傳代，仍然保持了良好的干細(xì)胞特性，貼壁分化細(xì)胞較少。免疫細(xì)胞

9、化學(xué)結(jié)果顯示，培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)GFP,并且大部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物nestin。表明培養(yǎng)細(xì)胞大部分為神經(jīng)干細(xì)胞。培養(yǎng)嗅球干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后，大部分表達(dá)早期神經(jīng)元標(biāo)記物NSE,表明培養(yǎng)細(xì)胞具有很強(qiáng)的向神經(jīng)元分化的能力；同時(shí)，部分誘導(dǎo)分化的細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)記物NF200,提示培養(yǎng)細(xì)胞分化后轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓纳窠?jīng)元細(xì)胞。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)為耳蝸移植干細(xì)胞提供了可示蹤的，易向神經(jīng)元方向分化的，體外擴(kuò)增容易的理想的種子細(xì)胞。

10、　　實(shí)驗(yàn)三：外側(cè)壁徑路耳蝸移植干細(xì)胞向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移途徑
　　目的：探討耳蝸外側(cè)壁干細(xì)胞移植后向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移能力，同時(shí)探討該手術(shù)對(duì)耳蝸形態(tài)和聽覺功能影響。
　　方法：選取成年SD雄性大鼠18只，實(shí)驗(yàn)分為三組，一組8只，運(yùn)用毒毛旋花子甙誘導(dǎo)SGNs損傷，2天后，耳蝸外側(cè)壁移植干細(xì)胞；一組正常大鼠兩只，分別經(jīng)耳蝸外側(cè)壁和鼓階注入熒光金顆粒，觀察細(xì)胞移植位點(diǎn)；一組正常大鼠8只，分為耳蝸外側(cè)壁手術(shù)和鼓階手術(shù)兩組，每組各4只8耳，分

11、別觀察耳蝸外側(cè)壁和鼓階模擬移植手術(shù)對(duì)正常耳蝸形態(tài)和聽覺功能的影響。
　　結(jié)果：移植1周后發(fā)現(xiàn)所有移植干細(xì)胞組耳蝸均有干細(xì)胞存活。移植的細(xì)胞主要分布在螺旋韌帶、基底膜、骨螺旋板和螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域，其他在鼓階、前庭階和中階也有少量分布。在一個(gè)耳蝸中，我們發(fā)現(xiàn)GFP+細(xì)胞只有少數(shù)停留在螺旋韌帶，大部分細(xì)胞已經(jīng)遷移到螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域，還有部分細(xì)胞位于螺旋韌帶和螺旋神經(jīng)節(jié)之間的基底膜及骨螺旋板。細(xì)胞分布提示我們基底膜具有潛在間隙允許移植干細(xì)胞從

12、螺旋韌帶向螺旋神經(jīng)節(jié)遷移。檢測(cè)到達(dá)神經(jīng)節(jié)區(qū)域移植細(xì)胞的分化情況，我們發(fā)現(xiàn)大部分移植細(xì)胞不表達(dá)Nestin，表明移植干細(xì)胞到達(dá)螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域后，大部分已經(jīng)分化，失去干細(xì)胞特性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)大部分GFP+細(xì)胞表達(dá)同時(shí)表達(dá)Tubulin，提示移植細(xì)胞到達(dá)螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域后，大部分已經(jīng)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。熒光金顆粒的分布差異表明我們采用的移植部位是準(zhǔn)確的。我們?cè)谡６伳M了手術(shù)操作；同時(shí)用鼓階作為對(duì)照。我們發(fā)現(xiàn)兩種手術(shù)對(duì)耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞沒有明顯影

13、響，耳蝸基底膜鋪片發(fā)現(xiàn)毛細(xì)胞基本沒有缺失，對(duì)手術(shù)前后耳蝸ABR閾值檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，耳蝸外側(cè)壁移植干細(xì)胞的方法對(duì)耳蝸功能影響有限。
　　結(jié)論：我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耳蝸外側(cè)壁移植干細(xì)胞是一個(gè)新的耳蝸移植細(xì)胞方法，該方法對(duì)正常耳蝸功能影響有限，移植的細(xì)胞可以遷移到螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域。
　　實(shí)驗(yàn)四：耳蝸移植干細(xì)胞遷移受CXCL12/CXCR4信號(hào)通道調(diào)控
　　目的：探討損傷微環(huán)境后CXCL12表達(dá)變化，移植干細(xì)胞在耳蝸遷移及分布與CXCL1

14、2之間關(guān)系。
　　方法：取體外培養(yǎng)小鼠嗅球來源干細(xì)胞（待移植細(xì)胞）檢測(cè)其CXCL12/CXCR4表達(dá)情況，取正常耳蝸、螺旋神經(jīng)元損傷耳蝸、螺旋神經(jīng)元損傷后2天后移植干細(xì)胞耳蝸組織切片，檢測(cè)CXCL12表達(dá)變化與干細(xì)胞遷移及分布關(guān)系。
　　結(jié)果：免疫熒光染色結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)CXCR4；同時(shí)具有分泌CXCL12能力；CXCL12在正常耳蝸即有表達(dá)，而在毒毛旋花子甙誘導(dǎo)螺旋神經(jīng)元損傷3天時(shí)，在變性、缺失神經(jīng)元細(xì)胞

15、周圍、蝸軸聽神經(jīng)中樞端和骨螺旋板聽神經(jīng)外周端，CXCL12表達(dá)明顯上調(diào)，損傷7天時(shí)，螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域表達(dá)CXCL12明顯下降，這一現(xiàn)象同時(shí)出現(xiàn)在聽神經(jīng)的中樞端和外周端。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，移植到前庭階的神經(jīng)干細(xì)胞在耳蝸內(nèi)有部分細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)CXCR4，在聚集的移植細(xì)胞團(tuán)中，CXCL12呈明顯的高表達(dá)；移植干細(xì)胞耳蝸發(fā)現(xiàn)，CXCL12在損傷部位表達(dá)濃度梯度分布，與干細(xì)胞在螺旋韌帶、基底膜、骨螺旋板和螺旋神經(jīng)節(jié)分布相吻合。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)