1、目的 關節(jié)軟骨損傷是骨科臨床的常見疾病。成熟關節(jié)軟骨的自身修復能力較差，除與軟骨內無血管、缺乏未分化的軟骨細胞及軟骨細胞被固定在一個致密的由膠原和蛋白多糖組成的固體基質中有關外，可能還與以下兩個因素有關：①內在修復依賴于軟骨細胞有絲分裂及短期內增加的代謝產物(主要是膠原和蛋白多糖)，而成熟軟骨細胞有絲分裂能力極低：②外部愈合依賴于來自軟骨下骨的間充質成分的參與，形成新的結締組織，經過一系列變化形成纖維軟骨。20世紀80年代以來，

2、組織工程技術的迅速發(fā)展，為這一難題的解決提供了前所未有的機遇。人們利用軟骨組織工程技術，將細胞和支架材料復合培養(yǎng)，修復軟骨缺損已經取得了初步成效。本課題研究的目的是采用軟骨組織工程技術，體外分離骨髓間充質干細胞(MSCs)培養(yǎng)、傳代后與軟骨細胞以7：3混合再與II型膠原支架材料和PLGA復合培養(yǎng)，觀察細胞在兩種支架材料上黏附、伸展和增殖情況，并觀察其在動物實驗中修復兔關節(jié)軟骨缺損的情況。期望能夠找到軟骨組織工程理想支架材料與種子細胞。

3、 材料和方法 1．取3-4月齡健康新西蘭大白兔，穿刺抽取雙側脛骨上端骨髓6-8ml，Percoll分離法分離骨髓間充質干細胞，進行原代、傳代細胞培養(yǎng)。 2．取3月齡新西蘭白兔關節(jié)非負重區(qū)關節(jié)軟骨，將軟骨片剪成0.3cmxo.3cm大小，以0.2％的II型膠原酶消化8-10分鐘，離心、洗滌、計數(shù)。將細胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中，加入10％胎牛血清培養(yǎng)液5ml，在37℃、5％CO<,2>、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生

4、長接近融合后，以0.25％的胰酶消化收集備用。 3．取經過培養(yǎng)6天的MSCs和軟骨細胞以7:3的比例混合，調整細胞濃度為4x10<'6>/ml，與PLGA、Ⅱ型膠原復合培養(yǎng)7天，進行復合組織的病理形態(tài)學觀察；動物實驗備用。觀察骨髓間充質干細胞在PLGA、Ⅱ型膠原內生長增殖情況。掃描電鏡觀察Ⅱ型膠原支架材料以及PLGA的結構、孔隙率和細胞在支架內的黏附和生長情況。 4．取3-4月齡健康新西蘭大白兔30只，在實驗兔的雙側股骨滑

5、車處鉆直徑4mm，深度4-5mm的骨軟骨缺損，深達軟骨下區(qū)。隨機分為2組：A組，15只，右膝軟骨缺損處植入混合細胞復合Ⅱ型膠原材料；B組，15只，右膝軟骨缺損處植入混合細胞復合PLGA材料；C組，空白對照組，為上述兩組的左膝軟骨缺損處，不植入任何材料。分別于術后4、8、12周各處死5只動物，進行大體和組織學觀察。 結果 1．細胞形態(tài)學改變 倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細胞接種后1-3日可見少量細胞貼壁，呈短梭形。3日后

6、出現(xiàn)細胞集落，7-8日廣泛集落形成。12-14同細胞形成單層。傳代細胞貼壁快，7-8日形成單層，細胞核大，胞漿內顆粒多。 2．組織學觀察：細胞在Ⅱ型膠原支架中分布、生長良好。細胞外基質豐富，可見細胞外基質片狀形成，甲苯胺藍染色顯示細胞周圍異染性基質。PLGA孔隙率差，復合的細胞較少。Ⅱ型膠原支架內復合細胞的數(shù)量明顯高于PLGA支架。 電鏡觀察：掃描電鏡顯示Ⅱ型膠原纖維呈網架狀結構，孔隙不規(guī)則，孔徑在100-200μ

7、m之間，孔壁厚度較均勻，為20-40μ m，孔隙率大于92％。復合材料顯示細胞在Ⅱ型膠原支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見到細胞分泌的基質和細胞偽足的鉚固作用，表明支架材料具有良好的細胞親和性。 PLGA孔隙規(guī)則，表面光滑，孔徑在200-300μ m之間，孔壁厚度較均勻，為10-30 μ m，孔隙率約為82％，細胞黏附欠佳，水容性差，組織相容性不如Ⅱ型膠原纖原。 3．動物實驗結果 大體觀察：術后12周，

8、A組缺損修復區(qū)組織與周圍關節(jié)軟骨相整合良好，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周圍軟骨組織外形無差異；B組缺損區(qū)修復組織與周圍軟骨大部分整合，新生組織較軟，局部可見小的孔隙，光澤較差；C組缺損處修復組織低凹，新生組織軟，無光澤，與周圍軟骨組織區(qū)別明顯。 組織學觀察：術后12周，A組骨和軟骨組織增生活躍，新生軟骨與周圍軟骨融合較好，軟骨細胞排列整齊，鏡下所見修復軟骨與正常軟骨之間無明顯差別。B組缺損區(qū)主要由透明變性的纖維組織填充并

9、伸延至兩側關節(jié)軟骨表面，底部及邊緣可見少量骨組織和軟骨增生，鏡下形態(tài)與正常軟骨組織區(qū)別很大。C組缺損區(qū)內主要為纖維組織。 結論： 1 軟骨細胞可分泌多種生長因子如：轉化生長因子TGF-β、胰島素樣生長因子(IGF)等。這些因子是公認的BMSCS軟骨分化誘導因子，軟骨細胞分泌的這些可溶性因子可能在BMSCs軟骨形成過程中發(fā)揮了重要作用。 2 BMSCs適合成為軟骨組織工程的種子細胞。取材方便，Percoll分

10、離法分離可以獲取大量骨髓基質干細胞，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴增，在與軟骨細胞共培養(yǎng)的誘導環(huán)境下，可以分化為軟骨細胞。 3 II型膠原是理想的軟骨組織工程支架材料。具有良好的孔隙率和組織相容性，BMSCs在其中可以很好地黏附、擴展和增殖。 4動物實驗研究中BMSCs與軟骨細胞復合II型膠原修復的軟骨缺損明顯優(yōu)于PLGA，與正常軟骨組織形態(tài)接近。表明BMSCs與軟骨細胞共培養(yǎng)復合的U型膠原材料是理想的軟骨組織