1、不同肌肉纖維類型肌球蛋白重鏈(Myosin Heavy Chain，MyHC)亞型基因是目前公認(rèn)的區(qū)分不同肌纖維類型的分子標(biāo)記，因此發(fā)現(xiàn)調(diào)控MyHC亞型基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對提高肉質(zhì)性狀和肉品質(zhì)具有重要的意義。FHL3蛋白屬于LIM蛋白超家族成員之一，不能結(jié)合DNA啟動子序列，只能通過結(jié)合其它轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因表達(dá)。迄今為止關(guān)于FHL3是否調(diào)控MyHC各亞型基因表達(dá)還未見報道。本研究以小鼠C2C12成肌細(xì)胞為模型，展開了FHL3對四種

2、MyHC亞型基因的影響及其調(diào)控的分子機(jī)制的研究，取得了如下主要研究結(jié)果:
　　1.利用構(gòu)建的FHL3超表達(dá)載體pcDNA3.1-FHL3和針對FHL3基因的干涉(siFHL3)片段轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞，采用實時定量PCR、Western blotting、和免疫熒光技術(shù)檢測了超表達(dá)和干涉FHL3基因前后MyHC各亞型基因表達(dá)變化;發(fā)現(xiàn)了FHL3對MyHC2a和MyHC2b有正調(diào)節(jié)作用，對MyHC1/slow有負(fù)調(diào)節(jié)作用，而對My

3、HC2x無影響。
　　2.開展了共轉(zhuǎn)染試驗，首先利用pcDNA3.1-FHL3和MyoD干涉片段共轉(zhuǎn)C2C12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)干涉MyoD同時超表達(dá)FHL3后MyHC2a，MyHC2b蛋白水平仍有顯著增加，而MyHC1/slow表達(dá)水平卻沒有顯著變化。之后利用pcDNA3.1-MyoD和FHL3干涉片段共轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)干涉FHL3后，增強(qiáng)了MyoD超表達(dá)對MyHC1/slow基因表達(dá)的促進(jìn)作用。以上結(jié)果表明FHL

4、3主要通過抑制MyoD轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)MyHC1/slow基因表達(dá)，而對MyHC2a，MyHC2b基因的表達(dá)調(diào)控可能存在其它機(jī)制。
　　3.開展了MyHC2a啟動子區(qū)域缺失片段與pcDNA3.1-FHL3共轉(zhuǎn)染C2C12成肌細(xì)胞試驗，發(fā)現(xiàn)FHL3超表達(dá)顯著提高了含有環(huán)化的AMP反應(yīng)元件(cyclicAMP-responsive elements，CRE)的啟動子活性，在此基礎(chǔ)上，通過CREB超表達(dá)和干涉試驗驗證了CREB能夠促進(jìn)MyH

5、C2a基因表達(dá)。
　　4.開展了pcDNA3.1-FHL3和CREB干涉片段(siCREB)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞試驗，驗證了FHL3是通過CREB蛋白調(diào)控MyHC2a基因表達(dá)，并且磷酸化CREB(pCREB)在調(diào)控MyHC2a基因表達(dá)中發(fā)揮著主要作用;利用免疫沉淀技術(shù)驗證了FHL3可以與CREB、pCREB、MyoD及其共轉(zhuǎn)錄激活因子p300相互結(jié)合，當(dāng)MyoD和pCREB兩種蛋白共同存在的情況下，F(xiàn)HL3與pCREB的結(jié)合能力更強(qiáng)。

6、>　　5.利用EMSA和ChIP技術(shù)檢測了CREB與MyHC2a基因啟動子CRE元件的結(jié)合能力。結(jié)果表明非磷酸化的CREB與pCREB都能結(jié)合MyHC2a啟動子上的CRE結(jié)合元件，但以pCREB結(jié)合為主，并且FHL3基因干涉后顯著降低了pCREB與MyHC2a啟動子的結(jié)合能力。
　　綜上所述，F(xiàn)HL3對MyHC2a和MyHC2b基因的表達(dá)具有正調(diào)節(jié)作用，對MyHC1/slow基因表達(dá)有負(fù)調(diào)節(jié)作用;FHL3通過抑制MyoD轉(zhuǎn)錄活性下