1、本課題的主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:(1)開(kāi)發(fā)了一個(gè)報(bào)告基因系統(tǒng),將6個(gè)CRE響應(yīng)元件與一個(gè)人工合成的TATATA盒相連,控制報(bào)告基因(螢火蟲熒光素酶,Luciferase)的表達(dá),能敏感地響應(yīng)細(xì)胞中cAMP水平的變化,這種報(bào)告基因系統(tǒng)(6CRE/TA/Luci)適合于Gs和Gi偶聯(lián)受體的藥物篩選.(2)將這樣的報(bào)告基因系統(tǒng)6CRE/TA/Luci與D1樣受體共同轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞,建成穩(wěn)定的細(xì)胞株(D5/CRE/TA/Luci/CHO和D1/

2、CRE/TA/Luci/CHO).(3)克隆D5的同時(shí),還克隆到了D5家族的一個(gè)新成員(D5B),D5B有98％與D5同源,95％與D5的假基因同源,它介于D5與D5的假基因之間,在與D5不同的地方,則與D5的假基因相同,與D5假基因不同的地方則與D5相同,編碼的蛋白比D5多一個(gè)氨基酸.D5B屬于Gs偶聯(lián)受體,與D5的不同主要在COOH端,對(duì)多巴胺的親和性比D5大一倍.(4)將klotho基因的啟動(dòng)子與一個(gè)報(bào)告基因(螢火蟲熒光素酶,Lu

3、ciferase)相連,轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞,建立了穩(wěn)定的細(xì)胞株,這種細(xì)胞用終濃度0.006％的H<,2>O<,2>處理,建成了衰老模型,在這種細(xì)胞中,klotho啟動(dòng)子受到抑制,螢火蟲熒光素酶的活性較低.(5)SBG530是一種草本植物的提取物,對(duì)klotho啟動(dòng)子有調(diào)控作用,筆者采用生物活性導(dǎo)向分離技術(shù),對(duì)SBG530進(jìn)行了活性物質(zhì)的分離.總之,我們采用報(bào)告基因技術(shù),建立了可行的高通量篩選模型,有效地篩選到了D1樣受體的激動(dòng)劑和kl