1、原發(fā)性肝癌是全球發(fā)病率很高的惡性腫瘤之一,目前據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界每年新發(fā)現(xiàn)病例超過26萬人,肝癌的發(fā)病率和死亡率均占我國(guó)癌癥中的第三位。肝癌的發(fā)生經(jīng)過多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)控,由啟動(dòng)、促癌和發(fā)展等多個(gè)步驟形成,涉及多個(gè)基因參與和突變,最終導(dǎo)致肝細(xì)胞由不典型增生直到肝細(xì)胞癌變,病因并不完全清楚。目前大部分研究認(rèn)為肝細(xì)胞癌的發(fā)生與肝硬化結(jié)節(jié)、乙型和丙型肝炎病毒感染、黃曲霉毒素、基因變異和地理環(huán)境因素密切相關(guān)。由于原發(fā)性肝癌經(jīng)血及淋巴液轉(zhuǎn)移早,局

2、部侵潤(rùn)性強(qiáng),多數(shù)確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展到了中晚期,預(yù)后較差。
　　 絕大多數(shù)肝癌患者在明確診斷時(shí)往往已進(jìn)入中、晚期,癌細(xì)胞已經(jīng)在肝臟內(nèi)外發(fā)生廣泛的轉(zhuǎn)移,雖然手術(shù)、介入、化療及放療等傳統(tǒng)治療手段在肝癌治療方面取得一些重大進(jìn)展,但肝癌患者的近期生存率和遠(yuǎn)期預(yù)后沒有明顯改善,因此,尋找新的治療方法成為了臨床醫(yī)生和科研工作者最關(guān)注的問題。
　　 目前除了醫(yī)院常用的傳統(tǒng)手術(shù)、化療和放射治療之外,隨著基因工程技術(shù)的日益成熟,許多醫(yī)院逐漸開展

3、了各種各樣的基因介導(dǎo)治療,這些基因治療技術(shù)包括自殺基因治療、免疫基因治療、導(dǎo)入抑癌基因治療、抗腫瘤血管基因治療等等,其中以腺病毒介導(dǎo)抗腫瘤血管基因治療方法已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)之一。
　　 早在二十世紀(jì)七十年代,Folkman首次提出了惡性腫瘤生長(zhǎng)依賴于新生血管的形成,新生血管供給惡性腫瘤生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng),這種觀點(diǎn)隨后被大量研究證實(shí)。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到1mm時(shí),如果沒有新生血管支持其生長(zhǎng),腫瘤便進(jìn)入休眠期或退化,如果新生的血管長(zhǎng)入腫瘤

4、組織,腫瘤將會(huì)快速生長(zhǎng)達(dá)到失去控制的體積。新血管提供給腫瘤氧和各種營(yíng)養(yǎng)并帶走代謝廢物。因此,抗腫瘤血管生成治療可以直接切斷腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移所依賴的營(yíng)養(yǎng)供給,此種方法現(xiàn)在已成為肝癌研究領(lǐng)域新亮點(diǎn)。
　　 近年研究表明新生血管形成僅在少數(shù)組織中存在,除了女性生殖子宮內(nèi)膜、胎盤組織和傷口修復(fù)等部位發(fā)生短暫的新生血管的現(xiàn)象,體內(nèi)的血管系統(tǒng)大部分時(shí)間是保持靜止?fàn)顟B(tài)的,體內(nèi)的部分組織中血管是否發(fā)生主要取決于局部促血管發(fā)生因子和血管抑制因子之間的

5、平衡狀態(tài)。一方面促血管生長(zhǎng)因子的上調(diào)促進(jìn)血管生成,另一方面血管生長(zhǎng)抑制因子水平的下調(diào)抑制血管生成。
　　 目前研究證明所有內(nèi)源性血管生長(zhǎng)抑制因子都能夠抑制動(dòng)物模型體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng),但是直接應(yīng)用血管生成抑制因子治療惡性腫瘤目前仍面臨許多問題:1)需要長(zhǎng)期應(yīng)用血管生成抑制因子；2)當(dāng)大劑量應(yīng)用可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生有害的免疫反應(yīng)。3)生產(chǎn)成本高導(dǎo)致巨額治療費(fèi)用使病人難易承擔(dān)。
　　 基因治療是通過生物載體或非生物技術(shù)將目的DNA或R

6、NA轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中使其能夠有效的進(jìn)行表達(dá),即在宿主細(xì)胞內(nèi)合成重組蛋白,作用于局部組織而發(fā)揮抗腫瘤的治療作用。這種基因治療的優(yōu)點(diǎn)是:1)借助外源基因的導(dǎo)入,使宿主細(xì)胞本身可以合成重組蛋白,從而減少了生產(chǎn)成本；2)基因治療是將目的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞內(nèi),使其能夠有效表達(dá),在腫瘤局部區(qū)域重組蛋白含量增多,明顯提高治療效果。
　　 如今,全世界正在進(jìn)行的二百多個(gè)臨床基因治療試驗(yàn)項(xiàng)目中約有半數(shù)是針對(duì)于惡性腫瘤治療的,而這其中又有一半的基因療

7、法又都是針對(duì)腫瘤細(xì)胞本身。目前應(yīng)用抑制血管生成的基因治療直接針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,因?yàn)檠軆?nèi)皮細(xì)胞遺傳性十分穩(wěn)定,目的基因可以在人體內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá)數(shù)月或數(shù)年,并且這種基因治療載體要比制造大量高純度的蛋白質(zhì)容易和減少許多花費(fèi)。
　　 目前,腺病毒作為基因治療中常用的載體工具,具有外源基因表達(dá)高效及轉(zhuǎn)染率高等優(yōu)點(diǎn),重組腺病毒在局部腫瘤組織中大量表達(dá)重組蛋白,在局部抑制腫瘤血管的生成,同時(shí)腺病毒感染腫瘤細(xì)胞還能誘發(fā)宿主抗腫瘤免疫反應(yīng),可以從

8、多種方面發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　 近年,研究者發(fā)現(xiàn)了一種新的內(nèi)源性血管生成抑制因子-canstatin蛋白,canstatin蛋白源于Ⅳ型膠原a2鏈C端非膠原區(qū)(NC1)結(jié)構(gòu)域,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移具有明顯的抑制性作用,可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡,從而發(fā)揮抑制新生血管形成及其生長(zhǎng)的作用。研究顯示,canstatin蛋白可以明顯抑制裸鼠人腎癌、前列腺癌、食管癌及卵巢癌的生長(zhǎng),但是canstatin蛋白對(duì)肝癌的抑制作用如何,由腺病毒介導(dǎo)的c

9、anstatin基因?qū)θ烁伟┑闹委熥饔萌绾?這些問題目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 在本研究中我們首先克隆了人canstatin基因,并構(gòu)建了其原核表達(dá)載體和重組canstatin蛋白,繼而證實(shí)了canstatin蛋白抑制肝癌生長(zhǎng)的作用,然后我們又構(gòu)建了攜帶canstatin基因的腺病毒載體,最后將攜帶canstatin基因的重組腺病毒注入小鼠肝癌移植瘤中,觀察小鼠肝癌移植瘤體積變化、病理變化、微血管密度和肝癌組織中caspase

10、-3及Flk-1表達(dá),探討其在肝癌治療中的作用。
　　 第一部分實(shí)驗(yàn)人canstatin cDNA基因的克隆
　　 目的:克隆人canstatin cDNA基因,分析其基因序列。
　　 方法：采用RT-PCR技術(shù),從新鮮人胎盤組織中提取目的基因canstatin cDNA,進(jìn)而克隆載體pGEM-T,然后獲得重組質(zhì)粒pGEM-T/canstatin,最后轉(zhuǎn)化E.coliDH5a,篩出陽性克隆基因,測(cè)定其序列。

11、>　　 結(jié)果：1％瓊脂糖凝膠電泳顯示,人胎盤組織中mRNA有3條清晰條帶(5S,18S,28S)；分光光度計(jì)測(cè)定顯示,mRNA的A260=0.878,A280=0.411,A260/A280=2.136,計(jì)算總RNA濃度為1.76g/L。RT-PCR擴(kuò)增物與目的基因canstatin長(zhǎng)度基本一致。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體PGEM-T連接處理后,轉(zhuǎn)化E.coli DH5a,可在有氨芐青霉素的LB平板上見到白色和藍(lán)色菌落,挑選相對(duì)較好5

12、個(gè)白色菌落做Bam HI和HindⅢ酶切鑒定,證實(shí)為陽性克隆。上海生物工程公司測(cè)定基因序列顯示,重組質(zhì)粒陽性克隆中的目的基因與GenBank公布的canstatin基因序列相同。
　　 結(jié)論：我們成功克隆了canstatin基因,為下一步利用canstatin蛋白抗肝癌治療研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分實(shí)驗(yàn)原核表達(dá)并重組人canstatin蛋白
　　 目的:構(gòu)建canstatin基因原核表達(dá)載體,表達(dá)并純化重組

13、人canstatin蛋白。
　　 方法：使用雙酶切從重組質(zhì)粒pGEM-T/canstatin上切下canstatin基因,插入到目的質(zhì)粒pET-22b(+)相應(yīng)位點(diǎn),轉(zhuǎn)化E.coli BL21,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)重組人canstatin蛋白表達(dá),使用SDS-PAGE電泳儀分析人canstatin蛋白表達(dá)情況。采用Ni-NTA柱親和層析并純化重組人canstatin蛋白,使用PBS對(duì)其透析復(fù)性。
　　 結(jié)果：從重組質(zhì)粒PGE

14、MT-T/canstatin切下目的基因canstatin cDNA,插入到質(zhì)粒pET-22b(+)相應(yīng)位點(diǎn),轉(zhuǎn)化E.coliBL21,挑選5個(gè)較好的菌落經(jīng)BamHI和HindⅢ雙酶切后做電泳鑒定,顯示所有菌落均含有2條特異性條帶,分別與目的基因及原質(zhì)粒對(duì)應(yīng)。SDS-PAGE電泳儀分析結(jié)果顯示在24KD出現(xiàn)新蛋白條帶,誘導(dǎo)后1h、2h、3h和4h表達(dá)蛋白占菌體總蛋白的比例分別為17.2％,17.8％,21.0％和22.4％。Ni-NTA

15、柱親和層析顯示,在125Mm和250mM洗脫液中均純化出人canstatin蛋白.
　　 結(jié)論：canstatin原核表達(dá)載體可以被成功構(gòu)建,并純化出重組人canstatin蛋白。
　　 第三部分實(shí)驗(yàn)探討重組人canstatin蛋白在體內(nèi)治療肝癌的療效
　　 目的:探討重組人canstatin蛋白在體內(nèi)治療肝癌的療效。
　　 方法：利用SMMC-7721肝癌細(xì)胞株建立30只裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,當(dāng)腫瘤長(zhǎng)

16、至直徑2-3m時(shí),隨機(jī)分3組,即PBS對(duì)照組,5-Fu治療組和canstatin蛋白治療組,各組均經(jīng)瘤體內(nèi)多點(diǎn)注射給藥。治療期間定期測(cè)量移植瘤大小及重量；治療后取出瘤體做常規(guī)病理檢查免疫組化染色,總療程為21天。
　　 結(jié)果：從治療第3天,canstatin治療組及5-Fu治療組移植瘤體積顯著小于對(duì)照組(P<0.05)；治療第6天,有非常顯著差異P<0.01。療程結(jié)束時(shí),雖然5-Fu治療組療效最顯著,但全身的毒副作用明顯,病理證

17、實(shí)肝臟損害嚴(yán)重。
　　 結(jié)論：重組人canstatin蛋白可顯著抑制肝癌組織生長(zhǎng),沒有明顯毒副作用,是肝癌患者較為理想的治療方法。
　　 第四部分實(shí)驗(yàn)構(gòu)建攜帶canstatin基因的腺病毒載體
　　 目的:利用基因工程技術(shù),構(gòu)建攜帶canstatin基因的腺病毒載體Ad-canstatin.
　　 方法：使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù),擴(kuò)增PET/canstatin載體上canstatin基因,雙酶切后

18、插入到pCA13質(zhì)粒相應(yīng)的位點(diǎn),成功構(gòu)建pCA13-Cans穿梭載體;pCA13-Cans與腺病毒骨架pBGHE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,經(jīng)3次病毒空斑純化得到重組腺病毒,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)鑒定重組腺病毒。經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒、采用氯化銫密度梯度法離心純化重組腺病毒并使用TCH150檢測(cè)重組腺病毒的滴度。
　　 結(jié)果：從PET/canstatin載體上成功擴(kuò)增出709bp含canstatin基因的DNA片段,將其插

19、入到pCA13質(zhì)粒中成功構(gòu)建了pCA13-Cans質(zhì)粒,并經(jīng)PCR及酶切鑒定正確后,與腺病毒骨架pBGHE3在293細(xì)胞內(nèi)同源重組獲得重組腺病毒,再經(jīng)PCR鑒定重組腺病毒構(gòu)建正確,命名為Ad-canstatin,使用TCH150檢測(cè)重組病毒的滴度為3.1×109pfu/ml。
　　 結(jié)論：獲得了高滴度重組腺病毒Ad-canstatin為進(jìn)一步研究其抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。
　　 第五部分實(shí)驗(yàn) Ad-Canstatin治療肝癌

20、實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:觀察Ad-Canstatin在小鼠肝癌瘤體內(nèi)抑制肝癌療效。
　　 方法：以SMMC-7721人肝癌瘤細(xì)胞建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型。首先培養(yǎng)人肝癌瘤細(xì)胞懸液,將24只裸鼠隨機(jī)均分成3組,每只裸鼠左側(cè)腋窩皮下注射瘤細(xì)胞懸液0.1ml(濃度為2×107/ml),等到裸鼠腫瘤體積生長(zhǎng)至50mm3左右時(shí),將荷瘤裸鼠隨機(jī)平均分成Ad-canstatin治療組、PBS對(duì)照組和GFP空載組,每組有8只荷瘤裸鼠。

21、每個(gè)腫瘤均行兩次瘤內(nèi)注射,間隔72小時(shí),Ad-canstatin組和GFP空載組裸鼠瘤內(nèi)注射病毒量分別為為8×109PFU,PBS對(duì)照組裸鼠注射0.1ml PBS。主要觀察指標(biāo)有:1、腫瘤生長(zhǎng)抑制率2、腫瘤體積生長(zhǎng)曲線。3、病理學(xué)檢查:在注射藥物30天后裸鼠均被處死,比較各組組織病理學(xué)變化。4、免疫組織化學(xué)方法檢查:檢測(cè)各組的腫瘤組織中caspase-3和Flk-1的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1.在注射Ad-canstatin基因

22、治療后第3天,Ad-canstatin組裸鼠的腫瘤體積明顯小于PBS和GFP組(P<0.05)；其后觀察發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間延長(zhǎng)各組裸鼠腫瘤體積均增大,但Ad-canstatin組裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度和腫瘤體積均顯著小于PBS和GFP組(P<0.05)。2.病理學(xué)檢測(cè)顯示,各組裸鼠瘤體內(nèi)均見有不同程度的壞死組織,Ad-canstatin治療組裸鼠瘤體內(nèi)的壞死組織顯著多于PBS和GFP組。3.Ad-Canstatin治療組Flk-1的表達(dá)明顯低于

23、PBS組和GFP組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=7.778,p<0.01)；4.Ad-canstatin治療組caspase-3的表達(dá)明顯高于GFP組和PBS組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別 x2=6.563和 x2=10.50,p<0.01)。
　　 結(jié)論：利用腺病毒載體Ad-Canstatin能夠成功抑制裸鼠肝癌組織的生長(zhǎng),并能夠降低肝癌組織中Flk-1的表達(dá)和提高caspase-3的表達(dá)。
　　 我們認(rèn)為Ad-canstat

24、in治療肝癌的作用機(jī)制是:一方面在腫瘤組織中表達(dá)canstatin蛋白從而抑制肝癌血管的生成,另一方面,可能是降低Flk-1的表達(dá)和提高肝癌組織caspase-3的表達(dá),促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡,從而也起到抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　 總之,canstatin蛋白作為新的內(nèi)源性血管生成抑制劑有望成為治療肝癌的新藥物,利用腺病毒介導(dǎo)canstatin基因治療肝癌不但能發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用而且能減少治療費(fèi)用,為肝癌治療開辟了新方法,未來將