1、目的： 在心臟特異性骨形態(tài)形成蛋白受體ⅠA(the bone morphogenetic protein receptorⅠ A，BMPRⅠ A，又名ALK3)基因敲除的小鼠模型中，純合子死于胚胎中期，同時伴有室間隔缺損(ventricular septal defect，VSD)。因此，分析ALK3及其下游基因Pax-8的表達對于探索心臟發(fā)育的信號轉導通路以及研究室間隔缺損與心肌細胞凋亡之間的關系意義重大。 方法：

2、 體內(nèi)實驗中，由20只雌性α-MHC Cre+/-，ALK3+/-小鼠與20只雄性ALK3F/F小鼠交配得到心臟特異性ALK3基因敲除的純合子小鼠(α-MHC Cre+/-，ALK3 F/-)與雜合子小鼠(α-MHC Cre+/-，ALK3 F/+)；由雌性與雄性Pax-8 KO+/-小鼠各10只交配得到Pax-8基因敲除的純合子小鼠(Pax-8 KO-/-)與雜合子小鼠(Pax-8 KO+/-)；由雌性與雄性C57d，鼠各10只交

3、配得到野生型小鼠(C57)。提取組織DNA，行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)鑒定小鼠基因型。通過光學顯微鏡與透射電子顯微鏡觀察ALK3和Pax-8基因敲除小鼠心臟組織細胞的病理形態(tài)學。使用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUN

4、EL)檢測心肌細胞的凋亡情況。采用高頻超聲技術觀察Pax-8基因敲除的純合子小鼠與雜合子小鼠的心臟結構、功能和血流動力學指標。體外實驗中，大鼠胚胎心肌細胞株(H9C2(2-1))轉染針對Pax-8基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，以反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcript-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot檢測干擾效率，

5、通過觀察細胞凋亡蛋白酶(caspase-3)活性評估細胞凋亡情況。 結果： 光鏡顯示ALK3和Pax-8基因敲除的純合子小鼠存在VSD現(xiàn)象。透射電鏡提示ALK3和Pax-8基因敲除的純合子小鼠心肌細胞超微結構的病理改變較雜合子及野生型小鼠嚴重。TUNEL法表明ALK3和Pax-8基因敲除的純合子小鼠心肌細胞凋亡指數(shù)(cardiac myocyte apoptosis index，CMAI)較雜合子及野生型小鼠高(P<0.

6、01)。高頻超聲心動圖提示Pax-8基因敲除的純合子小鼠與雜合子小鼠相比，左室內(nèi)徑(P<0.01)、二尖瓣血流峰值(P<0.01)和二尖瓣血流E/A比值(P<0.05)減小，左室射血分數(shù)(P<0.05)和縮短分數(shù)(P<0.05)增加。RNA干擾(RNA interference，RNAi)后，Pax-8 siRNA組的Pax-8 mRNA表達水平較陰性對照組和空白對照組分別下調60.30％(P<0.05)和63.09％(P<0.05)，

7、Pax-8蛋白質表達水平較陰性對照組和空白對照組分別下調50.38％(P<0.05)和54.17％(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組Pax-8 mRNA(P>0.05)和蛋白質(P>0.05)表達無顯著差異；Caspase-3活性測定中，Pax-8 siRNA組A405nm為0.179±0.075，較陰性對照組0.081±0.018(P<0.01)和空白對照組0.078±0.016(P<0.01)明顯升高。 結論：