1、保幼激素（Juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）是昆蟲體內(nèi)最重要的兩類內(nèi)分泌激素。昆蟲的生長(zhǎng)、蛻皮及變態(tài)嚴(yán)格受到JH和20E的協(xié)同調(diào)控。其中，JH主要維持幼蟲的生長(zhǎng)，而20E則在幼蟲蛻皮和幼蟲到蛹及蛹到成蟲的變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。研究JH和20E合成的調(diào)控，將有助于完善昆蟲內(nèi)分泌作用的分子機(jī)理。
　　家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是鱗翅目昆蟲研究的模式生物。盡管家蠶J

2、H和20E的合成途徑及信號(hào)傳導(dǎo)通路研究已有很多積累，但JH和20E合成的分子調(diào)控機(jī)制仍有待深入探究。本研究以JH和20E合成相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo)，利用生物信息學(xué)分析、遺傳操作及生物化學(xué)和分子生物學(xué)多種實(shí)驗(yàn)方法，在細(xì)胞、組織、個(gè)體水平探究了家蠶homeodomain轉(zhuǎn)錄因子對(duì)JH和20E合成的調(diào)控機(jī)制。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　1．Homeodomain轉(zhuǎn)錄因子Scr對(duì)家蠶JH合成的調(diào)控
　　1）家蠶顯性三眠突變（M3）幼蟲初期

3、JH滴度升高
　　相比于有5個(gè)幼蟲齡期的野生型（WT）家蠶，顯性三眠突變（M3）家蠶的幼蟲雖然只經(jīng)歷4個(gè)齡期，但其2齡和3齡齡期明顯延長(zhǎng)，體長(zhǎng)和體重自2齡開始顯著增加，4齡時(shí)的蟲體大小已與WT的5齡幼蟲相當(dāng)。M3在4齡末上簇，進(jìn)入由幼蟲到蛹的變態(tài)發(fā)育。
　　利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）的方法，我們測(cè)定了M3及WT幼蟲期JH的滴度變化。結(jié)果表明，JH滴度在 M3和 WT中均隨幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育逐漸降低，且在各齡初期最高，之后

4、迅速下降，眠期降至最低。值得注意的是，二齡期M3的JH滴度明顯高于WT。qRT-PCR分析顯示，JH應(yīng)答及信號(hào)傳導(dǎo)基因Kr-h1的時(shí)期表達(dá)模式與JH滴度的變化趨勢(shì)一致。此外，我們利用放射性免疫（RIA）的方法測(cè)定了M3及WT幼蟲期20E的滴度變化。結(jié)果表明，在兩個(gè)家蠶品系中，20E滴度均呈現(xiàn)在各齡初期最低、后期逐漸上升、眠期及上蔟期達(dá)到峰值的變化趨勢(shì)，且在M3和WT中無明顯差異。qRT-PCR分析顯示，20E應(yīng)答及受體基因EcR在M3和

5、WT中的時(shí)期表達(dá)模式無明顯差異。上述結(jié)果暗示，二齡初期較高的JH滴度與M3的突變表型密切相關(guān)。
　　我們用保幼激素類似物（JHA）烯蟲酯（methoprene）處理WT的2齡起蠶來分析 JH對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，大部分經(jīng) JHA處理的家蠶幼蟲各齡齡期有所延長(zhǎng)，蟲體顯著增大。更重要的是，其中少數(shù)個(gè)體于4齡末期提前上簇并開始變態(tài)發(fā)育，表現(xiàn)出與M3極其相似的表型。這表明對(duì)2齡起蠶進(jìn)行JHA處理不僅能夠延長(zhǎng)幼蟲齡期，

6、而且能夠誘導(dǎo)家蠶由四眠向三眠轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步暗示二齡期較高的JH滴度是導(dǎo)致M3突變的主要原因。
　　2）Scr基因與M3突變位點(diǎn)緊密連鎖
　　鑒于M3突變位點(diǎn)已被定位在家蠶6號(hào)染色體的24.1 cM附近，我們以家蠶基因組精細(xì)圖序列為基礎(chǔ)，采用定位克隆的策略對(duì)M3突變的潛在主控基因進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，M3突變位點(diǎn)被鎖定于家蠶6號(hào)染色體Bm_nscaf2853上約117.5 kb的區(qū)域內(nèi)。該區(qū)域僅包含一個(gè)預(yù)測(cè)的蛋白編碼基因，即ho

7、meodomain轉(zhuǎn)錄因子Scr（Sex combs reduced）編碼基因。進(jìn)一步的分析顯示，M3和WT中Scr基因的編碼區(qū)序列沒有差異。但與WT相比，M3的Scr基因在第二內(nèi)含子中存在多處轉(zhuǎn)座元件的插入或缺失，推測(cè)其很可能與M3的突變表型相關(guān)。
　　3）Scr調(diào)控JH合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄
　　鑒于Scr基因與家蠶M3突變連鎖，而M3突變的發(fā)生又與JH滴度的異常變化相關(guān)，我們推測(cè)Scr基因可能參與了家蠶JH合成的調(diào)控。為驗(yàn)

8、證這一假說，我們首先分析了Scr基因在WT家蠶幼蟲腦-心側(cè)體-咽側(cè)體（Br-CC-CA）復(fù)合體及前胸腺（PG）中的時(shí)期表達(dá)模式，其中CA和PG分別是JH和20E前體的合成場(chǎng)所。結(jié)果表明，Scr在Br-CC-CA中的時(shí)期表達(dá)模式與JH滴度的時(shí)期變化較為一致，而在PG中的時(shí)期表達(dá)模式與20E滴度的變化并無緊密聯(lián)系。此外，我們?cè)诩倚Q胚胎來源的細(xì)胞（BmE）中過表達(dá)了Scr基因，qRT-PCR分析顯示，Scr基因過表達(dá)能夠誘導(dǎo)JH合成相關(guān)基因上

9、調(diào)表達(dá)，但20E合成相關(guān)基因的表達(dá)卻不受影響。上述結(jié)果暗示，Scr可能通過調(diào)控JH合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來影響家蠶JH的合成。
　　在線預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，Allototropin、FPPS2及JHAMT等JH合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在 homeodomain轉(zhuǎn)錄因子的保守順式調(diào)控元件。我們進(jìn)一步開展了啟動(dòng)子截短、熒光素酶活測(cè)定以及凝膠阻滯分析（EMSA）等一系列實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)， Scr能夠直接結(jié)合Allototropin、JHAMT及F

10、PPS2啟動(dòng)子區(qū)域的相關(guān)順式調(diào)控元件。這表明Scr可直接調(diào)控JH合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)家蠶JH合成的調(diào)控。
　　2．Homeodomain轉(zhuǎn)錄因子Antp和POU-M2對(duì)家蠶20E合成的調(diào)控
　　1）Antp和POU-M2通過蛋白互作共同調(diào)控20E合成酶基因的轉(zhuǎn)錄
　　在線預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，Spook、Shroud、Phantom、Disembodied、Shadow等家蠶20E合成酶基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)hom

11、eodomain轉(zhuǎn)錄因子Antp（Antennapedia）及 POU-M2的順式調(diào)控元件。qRT-PCR結(jié)果表明，Antp和 POU-M2在家蠶幼蟲PG中的時(shí)期表達(dá)模式與20E合成酶基因的類似。這些線索暗示Antp和POU-M2可能對(duì)家蠶20E合成酶基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用。
　　我們重點(diǎn)分析了Antp和POU-M2對(duì)家蠶20E合成酶基因Phantom的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。啟動(dòng)子截短、熒光素酶活測(cè)定、EMSA、染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP

12、）等一系列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明，Antp和POU-M2通過直接結(jié)合Phantom啟動(dòng)子上的順式調(diào)控元件中相鄰的核心基序調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。更重要的是，我們通過pull-down和免疫共沉淀（Co-IP）等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Antp和POU-M2對(duì)Phantom的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是通過二者的蛋白相互作用來完成的。
　　2）Antp和POU-M2基因的RNAi影響家蠶20E合成并阻斷其變態(tài)發(fā)育
　　我們開展了家蠶Antp和POU-M2的RNAi實(shí)驗(yàn)。首先，我

13、們合成了Antp和POU-M2的dsRNA，并在剛上簇時(shí)分別注射家蠶。后續(xù)分析顯示，在dsRNA注射處理后48小時(shí)的家蠶PG中，Antp、POU-M2及大部分20E合成酶基因的表達(dá)均被顯著抑制，而血淋巴中的20E滴度以及表皮中20E應(yīng)答基因（EcR、E74A、βftz-f1和Br-C）的表達(dá)也明顯降低。dsRNA注射處理后60小時(shí)，對(duì)照個(gè)體已完成化蛹，而干涉?zhèn)€體的變態(tài)發(fā)育則被阻斷并最終死亡。上述結(jié)果進(jìn)一步在個(gè)體水平證實(shí)， Antp和PO