1、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)是一種危害性極大的昆蟲，每年都給我國及全世界造成巨大的經(jīng)濟損失，因而它的防治工作也越來越引起人們的重視。然而，傳統(tǒng)的殺蟲方式由于效果差、污染環(huán)境嚴重等問題而不再適合形勢的需要。生物農(nóng)藥殺蟲就是適應這一需要而產(chǎn)生的。其中，通過抑制其蛻皮來達到殺蟲目的是一條較好的途徑。這就需要對棉鈴蟲的蛻皮機理有非常詳細的了解，而整個蛻皮過程是一套復雜的涉及眾多基因參與的級聯(lián)反應過程。要全面認識這個過程，首先

2、要選好候選基因，然后進一步研究與之相關(guān)的基因和其他蛋白因子，以此類推，逐步掌握蛻皮過程機理。本實驗選擇的候選基因是棉鈴蟲蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子-激素接受子3基因。 激素接受子3(HormoneReceptor3)是一種蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(Molt-RegulatingTranscriptionFactor)，屬于孤兒核受體基因超家族，調(diào)控蛻皮過程中相關(guān)基因的表達，是蛻皮相關(guān)基因早期基因簇的典型表達產(chǎn)物，可與DNA上特定的序列結(jié)合，參與蛻

3、皮激素誘導的晚期基因的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)物的調(diào)控，是蛻皮級聯(lián)反應中的關(guān)鍵因子。棉鈴蟲蛻皮激素接受子3(HHR3)是HR3家族成員之一，它調(diào)控棉鈴蟲的蛻皮過程。棉鈴蟲HHR3基因全長1668bp，即HHR3蛋白為556個aa，分子量為61.16kDa。在大腸桿菌中表達得到的是GST-HHR3融合蛋白，分子量為94kDa左右。 本人選取棉鈴蟲為實驗材料，以已知的棉鈴蟲蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子-激素接受子3基因(HHR3)為候選基因，利用本實驗室提供

4、的在大腸桿菌融合表達的GST-HHR3進行了下游研究，然后提取棉鈴蟲基因組DNA，RsaI酶切消化后加上接頭，PCR擴增，以提高DNA片段的豐度，讓PCR產(chǎn)物與HHR3蛋白結(jié)合，再通過兔抗HHR3抗體免疫沉淀，得到結(jié)合有DNA片段的蛋白沉淀，經(jīng)三次洗滌后，酚氯仿抽提DNA，以此為模板進行PCR擴增。為了證明所得到的目的DNA片段不是抗體結(jié)合的，設(shè)計了對照實驗，即用PBS代替HHR3蛋白，結(jié)果沒有得到擴增產(chǎn)物，說明獲得的DNA片段是HHR

5、3蛋白所結(jié)合的。 為了闡明HHR3基因內(nèi)含子分布及大小情況，根據(jù)己知的HHR3基因序列，設(shè)計了多對特異性引物，再以棉鈴蟲基因組DNA為模板進行PCR擴增。通過比較擴增結(jié)果和已知HHR3基因序列，得到了一個內(nèi)含子序列，并證明了另外部分位置沒有內(nèi)含子。還有一段序列的內(nèi)含子不清楚，需要設(shè)計新的特異性引物進行研究。 另外，本文還應用T7SelectPhageDisplaysystem淘選了與HHR3結(jié)合的輔助蛋白因子。棉鈴蟲表皮