1、志賀菌病是由志賀菌屬細(xì)菌引起的一種腸道傳染性腹瀉，是夏秋季節(jié)最常見(jiàn)的腸道傳染病之一。該病流行廣泛，危害嚴(yán)重，可感染人及多種動(dòng)物，引起發(fā)病甚至死亡，危害人類(lèi)的健康，并給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)該病的防治以及生物疫苗的研究不僅具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)意義，而且具有重大的醫(yī)學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究用雞志賀菌IpaC蛋白、雞志賀菌菌體滅活疫苗以及兩者混合物作為免疫原分別免疫小鼠，對(duì)小鼠進(jìn)行體液免疫和細(xì)胞免疫功能測(cè)定及攻毒免疫保護(hù)試

2、驗(yàn)，取得了較好結(jié)果，為正確評(píng)價(jià)疫苗免疫效果，有效預(yù)防和控制該病提供了可靠的檢測(cè)手段和方法。研究結(jié)果如下：
　　1、雞志賀菌IpaC基因的克隆及表達(dá)
　　用PCR方法從重組質(zhì)粒pMD18-T-IpaC中擴(kuò)增出IpaC基因，將其克隆到表達(dá)載體pET32a中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-IpaC，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，以IPTG為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明成功表達(dá)了IpaC蛋白，在上清液和包涵

3、體中均有表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白分子量為63kD。上清液用Ni-Agarose His標(biāo)簽進(jìn)行純化至電泳純，測(cè)定并調(diào)整蛋白濃度為1mg/mL。Western-blot分析表明該蛋白可被單抗所識(shí)別，具有良好的免疫反應(yīng)原性。
　　2、雞志賀菌IpaC蛋白和菌體滅活疫苗及其混合疫苗的體液免疫作用
　　進(jìn)行體液免疫測(cè)定，首先制備三種不同的免疫原，分別為電泳純的IpaC蛋白（濃度1mg/mL）、雞志賀菌ZMD01株菌體滅活液（濃度1010

4、cfu/mL）和二者1：1的混合液，將以上三種抗原分成兩批，一批加弗氏完全佐劑用于首免，另一批加弗氏不完全佐劑用于二免加強(qiáng)免疫。首免后21d加強(qiáng)免疫，首免和二免各組均按小鼠皮下注射免疫0.2mL/只，并設(shè)PBS對(duì)照組。于不同時(shí)間采血進(jìn)行抗體測(cè)定，首免和二免均于免疫后7d和14d斷尾采血分離血清，用已建立的間接ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。結(jié)果表明，各免疫組小鼠的抗體幾何平均滴度（GMT）明顯高于同期的對(duì)照組（P＜0.05），在二免后1

5、4d達(dá)到最高峰，IpaC蛋白組、滅活菌體組和二者混合組三個(gè)組的抗體平均滴度分別為1:15241、1:16591、1:18093，PBS對(duì)照組為1:20，三個(gè)免疫組間的差異不明顯（P＞0.05），混合組GMT＞滅活菌體組GMT＞IpaC蛋白組GMT。
　　3、雞志賀菌IpaC蛋白和菌體滅活疫苗及其混合疫苗的細(xì)胞免疫作用
　　進(jìn)行細(xì)胞免疫測(cè)定，疫苗的種類(lèi)、動(dòng)物分組和免疫方法及采血時(shí)間同上述體液免疫測(cè)定。對(duì)二免后21d的各組小鼠用

6、四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（簡(jiǎn)稱(chēng)MTT法）檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)（SI）、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例、用山羊抗鼠ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IL-2和IFN-γ的水平。結(jié)果表明，①二免后21d，各免疫組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)均顯著高于PBS對(duì)照組（P＜0.05），各免疫組間差異不顯著（P＞0.05），混合組（2.241±0.243）略高于IpaC蛋白組（2.120±0.210），IpaC蛋白組又略高于滅活菌體組（2.085±

7、0.185）。②T淋巴細(xì)胞亞群分析表明，各免疫組的CD3+、CD4+的比例均略高于PBS對(duì)照組，而CD8+的比例略小于PBS對(duì)照組，IpaC蛋白組、滅活菌體組、混合組CD4+/CD8+的比值分別比PBS對(duì)照組高17.92％、26.27%、28.11%。③從首免7d開(kāi)始，除了PBS對(duì)照組外，其他各組的IL-2和IFN-γ的含量逐步上升，到二免后21d與PBS對(duì)照組有了極顯著的差異（P＜0.01），但是各免疫組間差異不顯著（P＞0.05）。

8、
　　4、攻毒免疫保護(hù)試驗(yàn)
　　首先測(cè)定菌株的半數(shù)致死量（LD50），用六個(gè)不同菌數(shù)的志賀菌ZMD01株感染劑量對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，觀(guān)察記錄每個(gè)劑量的小鼠死亡數(shù)量，攻毒后7d統(tǒng)計(jì)死亡情況，用Bliss方法計(jì)算出志賀菌ZMD01株對(duì)小鼠的LD50。用LD50劑量對(duì)二免后21d各組的小鼠進(jìn)行攻毒，觀(guān)察記錄各組小鼠的發(fā)病情況。結(jié)果顯示，發(fā)病小鼠精神沉郁、食欲降低、糞便有異常。攻毒后7d各組小鼠存活率分別為：IpaC蛋白組5/10，滅活

9、菌體組5/10，混合組6/10，PBS組3/10。剖檢病變主要為肝臟腫大，呈紅褐色，有出血；脾臟有出血并且腫大；腸道腫脹，腸壁變薄，有少量出血現(xiàn)象。在發(fā)病小鼠的肝臟、脾臟和腸內(nèi)容物中均回收到病原菌。
　　結(jié)論：雞志賀菌IpaC基因可進(jìn)行原核有效表達(dá)，表達(dá)蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性；雞志賀菌IpaC蛋白和菌體滅活疫苗及其混合疫苗均具有良好的體液免疫和細(xì)胞免疫增強(qiáng)作用及較好的免疫保護(hù)作用，且混合疫苗的作用均高于其它兩組，混合疫苗有望成