1、背景和目的 慢性腦缺血(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是臨床上常見的病理狀態(tài)，臨床上一般指由于長期腦血供不足導(dǎo)致的頭暈、頭重或異麻感等，它可能在動脈粥樣硬化、Alzheimers病(AD)、血管性癡呆(vascular dementia,VD)、Parldnson病等多種疾病的病理過程中有重要作用，尤其是近年來有研究表明它可能是AD最重要的啟動和維持機制之一。盡管CCH致AD的病機不十分清

2、楚，但血管因素為臨床防治AD提供了一個方向，這使得擴血管物質(zhì)一氧化氮(nitric oxide，NO)成為防治AD的靶點之一。 NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化產(chǎn)生，是一種重要的擴血管物質(zhì)，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它既能作為突觸傳遞的長時程增強(10ngterm potentiation，LTP)效應(yīng)的關(guān)鍵信使在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用，也參與急性缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展。N

3、OS分三型，在急性腦缺血時，內(nèi)皮型NOS(endothelialNOS，eNOS)產(chǎn)生的NO有神經(jīng)保護作用，而神經(jīng)型NOS(neuronal NOS，nNOS)和誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS，iNOS)過度表達所產(chǎn)生的NO有神經(jīng)毒性作用(也有研究表明nNOS有保護作用)。尋求能對NOS亞型進行選擇性干預(yù)的藥物也可能具有潛在的臨床價值。但是，在CCH所致癡呆的病理過程中，NO/NOS是否也和急性缺血一樣有雙重作用尚缺乏相關(guān)研究

4、。 尼莫地平作為Ca<'2+>通道拮抗劑具有神經(jīng)保護作用，臨床上可用來防治癡呆，其具體機制不明。本試驗擬用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎制作CCH大鼠模型，并用尼莫地平進行干預(yù)，觀察大鼠認知能力的變化和海馬CAl區(qū)NOS亞型的表達情況，由此探討：NOS亞型在CCH中的作用和尼莫地平的神經(jīng)保護機制，為尼莫地平防治癡呆提供進一步的實驗依據(jù)。 材料與方法 1．實驗動物分組：選用10～12個月的健康雄性SD大鼠30只，體重300～3

5、50g，隨機分為三組：假手術(shù)組、單純?nèi)毖M和缺血治療組，每組10只。 2．動物的處理： (1)鈍性分離單純?nèi)毖M和缺血治療組大鼠雙側(cè)頸總動脈，用0號手術(shù)線分別結(jié)扎其近心端及遠心端，并從中間剪斷；分離假手術(shù)組雙側(cè)頸總動脈但不結(jié)扎，也不剪斷。術(shù)后各組大鼠均在常規(guī)條件下飼養(yǎng)60天。術(shù)前及術(shù)后每周測量血壓1次。 (2)缺血治療組于術(shù)后24小時開始灌胃，尼莫地平用0.5﹪羧甲基纖維素鈉溶液溶化后按1mg/kg灌胃，每天兩次

6、，連續(xù)60天。單純?nèi)毖M和假手術(shù)組分別灌以等量0.5﹪羧甲基纖維素鈉溶液。 (3)手術(shù)60天后用Y型迷宮對每組大鼠進行認知能力測試。 (4)認知能力測試后處死大鼠，腦組織用4﹪的多聚甲醛固定后石蠟切片，做HE染色和免疫組化染色。 3．觀察指標(biāo)： (1)血壓：用無創(chuàng)血壓計測尾動脈血壓，觀察造模及尼莫地平是否影響血壓。 (2)認知能力：采用Y型電迷宮進行主動逃避學(xué)習(xí)能力測試。大鼠學(xué)習(xí)成績以達到連續(xù)10

7、次測試中有至少9次(≥90﹪)正確反應(yīng)時所需的電擊次數(shù)表示。 (3)HE染色：光鏡下觀察腦組織病理變化。 (4)用免疫組化法觀察nNOS、iNOS和eNOS的表達，觀察6個不連續(xù)的高倍視野，測灰度值。 5．統(tǒng)計方法：所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差(x±s)表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS10.0進行數(shù)據(jù)處理，用單因素方差分析進行組間比較，取α=0.05作為檢驗水準。 結(jié)果 1．一般情況：術(shù)后大鼠均出現(xiàn)精神萎靡，

8、反應(yīng)遲鈍，進食減少，術(shù)后1天假手術(shù)組精神恢復(fù)，反應(yīng)靈敏，進食增多，缺血治療組有所改善但相對較差。飼養(yǎng)過程中，假手術(shù)組反應(yīng)靈敏，而單純?nèi)毖M精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，自潔能力差，缺血治療組介于二者之間。各組手術(shù)前后血壓無明顯變化(P>0.05)，缺血治療組用尼莫地平前后血壓無明顯變化(P>0.05)。 2.認知能力：假手術(shù)組、單純?nèi)毖M和缺血治療組達到標(biāo)準所需電擊次數(shù)分別為35.50±5．10、81.60±5.95、58.60±7.2

9、3，相互之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示造模后認知能力下降，經(jīng)尼莫地平治療后，認知能力改善。 3.HE染色：假手術(shù)組偶有神經(jīng)細胞變性、死亡，大部分細胞形態(tài)正常未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化；單純?nèi)毖M見大量神經(jīng)細胞變性、壞死，核濃縮，空泡變性，白質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)散在性神經(jīng)纖維及髓鞘潰變；缺血治療組變性、死亡神經(jīng)細胞較單純?nèi)毖M明顯減輕。 4．nNOS免疫組化染色：取海馬CA1區(qū)進行統(tǒng)計分析，假手術(shù)組、單純?nèi)毖M及缺血治療組nN

10、OS灰度值分別為57.50±10.11、34.90±5.22、43.10±6.56，相互之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示造模后nNOS表達下降，經(jīng)尼莫地平治療后，nNOS表達提高。 5.iNOS免疫組化染色：取海馬CA1區(qū)進行統(tǒng)計分析，假手術(shù)組、單純?nèi)毖M及缺血治療組iNOS灰度值分別為10.40±3.50、82.70±2.80、63.60±6.57，相互之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示造模后iNOS表達上調(diào)

11、，經(jīng)尼莫地平治療后，iNOS表達下降。 6．eNOS免疫組化染色：取海馬CAl區(qū)進行統(tǒng)計分析，假手術(shù)組、單純?nèi)毖M及缺血治療組eNOS灰度值分別為62.40±4.20、21.20±2.74、38.30±3.13，相互之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01．)，提示造模后eNOS表達下降，經(jīng)尼莫地平治療后，eNOS表達提高。 結(jié)論 1.CCH使海馬CA1區(qū)nNOS和eNOS表達下降，iNOS表達升高，這些改變都與認知功