1、糖尿病是病人及其家庭的沉重負(fù)擔(dān)，對(duì)該病的治療也是醫(yī)學(xué)界長(zhǎng)久以來(lái)的一個(gè)難題。約30～50％以上的糖尿病病人會(huì)出現(xiàn)的并發(fā)癥，進(jìn)而導(dǎo)致生活質(zhì)量降低，生存時(shí)間縮短，醫(yī)藥費(fèi)增加。糖尿病病人持續(xù)的高血糖是發(fā)生并發(fā)癥的決定性危險(xiǎn)因素。目前，保持長(zhǎng)期穩(wěn)定的正常血糖，同時(shí)避免低血糖危險(xiǎn)的唯一途徑，就是替換病人的胰島：包括帶血管的胰腺移植，或者注射純化的胰島細(xì)胞。在最近的20年，胰腺移植治療糖尿病效果顯著—能夠預(yù)防和逆轉(zhuǎn)糖尿病并發(fā)癥，改善生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存

2、時(shí)間，而且醫(yī)療費(fèi)用有所減少。胰腺移植的成功提示，在長(zhǎng)期的非特異性免疫抑制狀態(tài)下，胰島β細(xì)胞替代治療效果確切。胰島移植屬于細(xì)胞移植范疇，是侵入性最小的β細(xì)胞替代療法，與胰腺移植相比具有安全、簡(jiǎn)便、利于體外移植物修飾、不良反應(yīng)低和可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，短期療效令人滿意，已成為很有發(fā)展前景的方法。 但是，當(dāng)前的胰島移植仍存在供胰需要量大，胰島移植物代謝活性差，存活率低等問題。因此，胰島移植的遠(yuǎn)期療效仍不樂觀。造成這些問題的原因很多。首先，

3、胰島制備的質(zhì)量對(duì)移植胰島功能的恢復(fù)起到重要影響，在胰島分離純化過程中始終要注意保護(hù)胰島的存活和功能。其次，移植后受體自身免疫性疾病復(fù)發(fā)導(dǎo)致的胰島死亡，移植物再血管化延遲引起的胰島持續(xù)缺血缺氧，移植物進(jìn)入體內(nèi)面臨的炎癥反應(yīng)，以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等，均可引起胰島移植物的破壞。而且，上述因素不僅可以直接損傷胰島，還可以活化各種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ，以及一氧化氮(NO)等，對(duì)胰島移植

4、物產(chǎn)生嚴(yán)重的損害。 近年來(lái)的研究表明，IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子對(duì)胰島的損害主要通過刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NO synthase，iNOS)過度表達(dá)來(lái)完成的。在這些細(xì)胞因子的作用下，胰島中的β細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可大量表達(dá)iNOS，催化生成過量的NO，后者作為效應(yīng)分子發(fā)揮對(duì)胰島β細(xì)胞的損害作用。本實(shí)驗(yàn)使用RNA干擾和iNOS抑制劑氨基胍，抑制iNOS的表達(dá)與活性，觀察胰島的存活和功能，從而明確iNOS/NO

5、對(duì)胰島的損害作用，探索保護(hù)胰島功能的途徑。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、胰島的分離和純化 普通級(jí)封閉群 Wistar大鼠，體重200-250g。采用腹腔內(nèi)注射10％的水合氯醛麻醉，膠原酶V原位灌注，快速切取，水浴消化。消化液呈乳糜狀、外觀不透明時(shí)迅速倒入冷的Hank's液，加滿50ml離心管以終止消化，并且輕輕振蕩混勻后低溫離心一次。再經(jīng)80目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，以去除大快的組織和線結(jié)，再次離心。然后采用Ficoll不連續(xù)密度梯

6、度離心純化胰島。 二、胰島培養(yǎng)及分組 胰島分離純化后懸浮于RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為20IEQ/孔，培養(yǎng)條件為：37℃、5％二氧化碳、95％空氣。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃榭瞻讓?duì)照組、RNA干擾組、氨基胍組、細(xì)胞因子組、RNA干擾+細(xì)胞因子組、氨基胍+細(xì)胞因子組。 三、轉(zhuǎn)染 使用iNOS的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的胰島。分別將轉(zhuǎn)染試劑與siRNA用不含血清和抗菌素的培養(yǎng)基稀釋后混合，形成siRNA-轉(zhuǎn)染試

7、劑混合液。將siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液加入含有胰島的培養(yǎng)基中，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h后將培養(yǎng)基更換為含有血清和抗菌素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h。 四、RT-PCR RT-PCR檢測(cè)胰島組織中iNOS RNA水平，以反映RNA干擾效果。同時(shí)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax和Fas的表達(dá)，以反映胰島的凋亡情況。GAPDH作為內(nèi)參照。 五、Western-blot Western-blot檢測(cè)iNOS蛋

8、白的表達(dá)，檢測(cè)RNA干擾的效果，β-actin作為內(nèi)參照。 六、檢測(cè)No和iNOS NO試劑盒通過硝酸還原酶法檢測(cè)培養(yǎng)液NO水平，NOS試劑盒檢測(cè)胰島組織iNOS活性。 七、胰島活性鑒定 胰島分離純化培養(yǎng)后，用丫啶橙/溴乙啶(AO/EB)熒光染色觀察胰島活性。將AO/EB與胰島制備物混合孵育10min，在熒光顯微鏡下觀察。AO對(duì)活細(xì)胞染色發(fā)出綠色熒光，EB對(duì)死細(xì)胞染色呈桔黃或桔紅色熒光。 八、胰島

9、功能檢測(cè) 胰島素釋放實(shí)驗(yàn)，胰島用Kreb's-Hank's液(含有10mmol/L的HEPES和0.25％牛血清白蛋白)液洗滌二次，計(jì)數(shù)10IEQ胰島。先用含低濃度葡萄糖(2.8mmol/L)的Kreb's-Hank's液孵育2h，然后用含有高濃度葡萄糖(16.7mmol/L葡萄糖)的Kreb's-Hank's液孵育1h。收集第2h和第3h的培養(yǎng)液并去除附著的細(xì)胞和碎片，采用放免法檢測(cè)培養(yǎng)液中胰島素含量，計(jì)算胰島素釋放指數(shù)(Se

10、cretion Index，SI)。 SI=第3h(高糖環(huán)境)的胰島素含量/第2h(低糖環(huán)境)的胰島素含量。 九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所用數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、胰島獲得量、純度及活性 采用名尼蘇達(dá)大學(xué)改良法，平均每只大鼠可獲得約500-600IEQ胰島，STZ染色提示純度在80％以上，AO/EB熒光染色顯示新

11、鮮分離的胰島存活率>95％。 二、RNA干擾效果 在培養(yǎng)的胰島中加入細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α后，iNOS-mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，而RNA干擾能夠抑制這種細(xì)胞因子的刺激作用，使iNOS-mRNA表達(dá)減弱，并阻止iNOS蛋白產(chǎn)物的合成。上述結(jié)果提示，RNA干擾技術(shù)可以成功的沉默大鼠胰島組織的iNOS基因，抑制iNOS蛋白生成。 三、胰島培養(yǎng)液中NO水平及胰島組織中iNOS活性 新分離純化的胰島中iNOS

12、活性較低，培養(yǎng)液中NO含量較少；而用細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α處理胰島24h后，iNOS和NO水平均明顯升高。而當(dāng)細(xì)胞因子和氨基胍共同加入培養(yǎng)基時(shí)，胰島iNOS活性受到顯著抑制，NO水平也明顯降低。提示氨基胍可以抑制iNOS活性，效果確切。 四、胰島活性 AO/EB染色顯示，新分離純化后的胰島存活率>95％；而與細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α共同培養(yǎng)24h后，胰島大量死亡。當(dāng)使用RNA干擾或誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抑制劑氨

13、基胍，與細(xì)胞因子共同作用于胰島時(shí)，AO/EB染色顯示胰島存活情況明顯改善。 五、胰島凋亡 胰島經(jīng)細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α處理后，促凋亡基因Bax和Fas表達(dá)明顯升高，提示這兩種細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)胰島細(xì)胞凋亡。而經(jīng)RNA干擾沉默iNOS基因后，胰島與細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α共同培養(yǎng)時(shí)，促凋亡基因表達(dá)明顯下降。 六、胰島功能 新分離純化后的胰島功能較好，基礎(chǔ)胰島素分泌量和胰島素釋放指數(shù)較高；而與細(xì)胞

14、因子IL-1β和TNF-α共同培養(yǎng)24h后，胰島分泌量和釋放指數(shù)明顯下降，提示胰島功能遭到破壞。使用RaNA干擾或氨基胍處理后的胰島，再同細(xì)胞因子共同培養(yǎng)時(shí)，胰島素分泌和釋放指數(shù)均明顯高于細(xì)胞因子組，胰島功能得到保護(hù)。 結(jié)論： 一．在IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子的刺激下，胰島組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)可大量表達(dá)，催化合成的高濃度NO是β細(xì)胞損傷的效應(yīng)因子。 二．使用RNA干擾技術(shù)特異性沉默iNOS基