1、血栓栓塞性疾病為臨床常見病，嚴重危害著人類的生命和健康。其病因及發(fā)病機制十分復雜，迄今尚未完全闡明，目前認為血小板功能異常和血管內(nèi)皮細胞損傷是血栓形成的重要因素。血栓形成是心腦缺血性疾病的主要致病因素之一。研究表明，腦缺血時，血小板功能異常亢進，血液處于高凝狀態(tài)，這是造成繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一?？梢姡寡“寰奂幬锏拈_發(fā)與應用是治療腦血管疾病的有效手段，尋找有效的抗血栓藥物具有重要的臨床意義。
　　 2-（α-羥基戊基）苯

2、甲酸鉀鹽（dl-PHPB）是中國醫(yī)學科學院藥物研究所自行設計合成的全新化合物，并已被國家食品藥品監(jiān)督局批準作為抗缺血性腦卒中新藥進行臨床研究。我室前期研究結(jié)果表明，dl-PHPB能夠顯著縮小大鼠大腦中動脈阻斷(MCAO)后的腦梗死面積，改善神經(jīng)功能缺失癥狀，減輕腦水腫體積，增加局部腦血流量，抑制大鼠血小板聚集和血栓的形成。但對其抗血小板聚集、抑制血栓形成的作用機制沒有深入研究。本研究主要從血小板活化、聚集、凝血系統(tǒng)、纖溶系統(tǒng)以及血管內(nèi)皮

3、細胞保護等幾方面觀察dl-PHPB的作用，并研究其機制，以期尋找其作用靶點。同時與其它的活血化淤中藥，如葛根素和丹酚酸B相比較，為進一步闡明中藥抗血小板聚集的機制，開發(fā)更有效的抗血小板中藥提供理論和實驗依據(jù)。
　　 血小板功能活化亢進是血栓形成的重要因素，我們首先研究了dl-PHPB對血小板功能的影響。血小板聚集活性的檢測一直是血小板體外功能評價的金標準，本次研究采用體內(nèi)給藥，體外檢測的方法，觀察了dl-PHPB對血小板聚集功能

4、的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dl-PHPB可劑量依賴性地抑制AA、COL、ADP誘導的血小板聚集，且對ADP引起的血小板聚集的抑制作用最強。在本研究中我們以ADP為誘導劑，探討了dl-PHPB對血小板聚集的信號通路的影響及可能的作用靶點。
　　 ADP與血小板膜上的G蛋白受體結(jié)合，目前已知ADP受體主要有P2Y1和P2Y12兩種受體亞型。P2Y1偶聯(lián)Gq蛋白，激活PLCβ，水解PIP2產(chǎn)生IP3和DAG，引起鈣離子釋放，增加胞漿[Ca2+

5、]i;P2Y12偶聯(lián)Gi蛋白，抑制腺苷酸環(huán)化酶，降低cAMP，最終引起血小板聚集。本研究結(jié)果顯示，無論細胞外液是否存在Ca2+，dl-PHPB均能明顯降低ADP誘導的血小板胞漿游離鈣含量，而且對內(nèi)鈣釋放的抑制作用強于抑制外鈣內(nèi)流。同時dl-PHPB增加磷酸化PLCβ(ser1105)的蛋白表達，不影響PLC總蛋白的表達。PLC激動劑部分逆轉(zhuǎn)dl-PHPB的抗血小板聚集作用。dl-PHPB明顯抑制ADP引起的血小板IP1含量增加，對PLC

6、激動劑引起的IP1增加無明顯影響。以上結(jié)果表明，P2Y1受體參與了dl-PHPB的抗血小板聚集作用。PGE1可使血小板中cAMP含量迅速增加，ADP與P2Y12受體結(jié)合，降低cAMP含量，拮抗PGE1的作用?？寡“逅庎缏绕ザㄞ卓笰DP與P2Y12受體的結(jié)合，增加cAMP含量。研究結(jié)果顯示dl-PHPB并不影響cAMP的含量，與噻氯匹定的作用不同。同時dl-PHPB對PI3K、Akt及磷酸化Akt的蛋白表達無明顯影響，提示dl-PHPB

7、并不通過P2Y12受體信號通路發(fā)揮作用。
　　 凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)、PGI2和TXA2的動態(tài)平衡，同樣影響血小板的聚集功能。本研究檢測了靜脈給予dl-PHPB對大鼠凝血系統(tǒng)功能、纖溶系統(tǒng)活性以及PGI2和TXA2含量的影響。結(jié)果顯示dl-PHPB增加大鼠血漿6-keto-PGF1α含量，減少PAI-1含量，對凝血時間、血漿中t-PA和TXB2的含量無影響。另外，我們也觀察了dl-PHPB對血小板活化功能的影響，結(jié)果顯示dl-PH

8、PB顯著降低血小板表面CD62P的表達，抑制了血小板活化。
　　 血管內(nèi)皮細胞功能的完整性對于維持血液的正常流動和抗血栓功能的發(fā)揮起著非常重要的作用。本研究以離體培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)作為實驗對象，觀察了dl-PHPB對脂多糖(LPS)損傷的內(nèi)皮細胞的保護作用，同時檢測了各組中黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達。結(jié)果顯示，不同濃度的LPS作用24h后，HUVEC存活率明顯下降，黏附分子ICAM-1和VCAM-

9、1的釋放量明顯增加。dl-PHPB提高了LPS損傷的內(nèi)皮細胞的存活率，抑制ICAM-1的釋放，對VCAM-1含量無明顯影響。
　　 以上研究結(jié)果提示，dl-PHPB明顯抑制血小板聚集、增強纖溶系統(tǒng)活性，抑制血小板活化，升高PGI2/TXA2比值，保護損傷內(nèi)皮細胞，抑制細胞間黏附分子ICAM-1的釋放，對凝血系統(tǒng)活性沒有影響。dl-PHPB通過拮抗P2Y1受體，抑制PLC活性，降低血小板胞漿游離鈣濃度，抑制血小板活化，從而抑制了A

10、DP誘導的血小板聚集。與臨床使用的抗血小板藥物噻氯匹定的作用靶點并不相同。
　　 傳統(tǒng)的活血化瘀中藥有很多具有抗血小板作用，但對其研究多集中于一些表面現(xiàn)象的研究階段，缺乏對抗血小板作用機制的深入研究。葛根素和丹酚酸B是兩個傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有明顯的抗血小板聚集，抑制血栓形成的作用，廣泛用于缺血性心腦血管疾病。本研究也觀察了葛根素和丹酚酸B對多種誘導劑誘導的血小板聚集的抑制作用，并對其抗ADP誘導的血小板聚集的機制與dl-PH

11、PB進行比較，旨在尋找其作用靶點的異同，為祖國中藥的進一步開發(fā)和深入研究提供依據(jù)。
　　 本研究結(jié)果顯示，葛根素和丹酚酸B均明顯抑制ADP誘導的大鼠血小板聚集。其中葛根素抑制ADP引起的IP1蓄積，但對PLC激動劑引起的IP1蓄積沒有作用，這一結(jié)果提示，P2Y1受體-PLC信號通路參與了葛根素的抗血小板聚集作用，與dl-PHPB作用靶點相似；丹酚酸B對ADP和PLC激動劑引起的IP1蓄積均無明顯抑制作用，提示丹酚酸B抗血小板聚集