1、背景:
　　 原林教授提出的筋膜學(xué)兩系統(tǒng)理論認(rèn)為:人體由非特異性結(jié)締組織筋膜支架構(gòu)成的支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)和被該筋膜支架所包繞的功能系統(tǒng)所構(gòu)成。支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)以干細(xì)胞為核心，可為功能系統(tǒng)的更新提供細(xì)胞補(bǔ)充，并為功能系統(tǒng)的各種功能細(xì)胞的更新、代謝提供一個(gè)較為穩(wěn)定內(nèi)部環(huán)境和干細(xì)胞源。疏松結(jié)締組織是支持與儲(chǔ)備系統(tǒng)重要的組成部分，其中的脂肪源干細(xì)胞(adipose-derivedstem cells，ADSCs)是機(jī)體重要的干細(xì)胞儲(chǔ)備之一。<

2、br>　　 目前對(duì)脂肪源干細(xì)胞的研究已取得重大進(jìn)展。脂肪源干細(xì)胞是從脂肪組織中獲取的一類(lèi)具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，稱(chēng)之為adipose-derived stem cells(ADSCs)。Zuk等首次從人的脂肪組織懸液中分離出了可以在體外穩(wěn)定增殖、具有多向分化能力的脂肪組織提取細(xì)胞(processed lipoaspirate cells，PLA細(xì)胞)。與其他成體干細(xì)胞比較，PLA細(xì)胞具有來(lái)源廣泛、取材方便，創(chuàng)傷小且不存在免疫排斥

3、反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)證明ADSCs具有跨胚層的多向分化潛能。它可以分化成中胚層來(lái)源的脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞，外胚層來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞，也可以分化成內(nèi)胚層來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞，及肝細(xì)胞等。但脂肪干細(xì)胞是否能夠向生殖細(xì)胞方向分化呢？
　　 生殖細(xì)胞(germ cell)是多細(xì)胞生物體內(nèi)能繁殖后代的細(xì)胞的總稱(chēng)，包括從原始生殖細(xì)胞直到最終已分化的生殖細(xì)胞。人類(lèi)胚胎發(fā)育到第3周末，胚胎產(chǎn)生三個(gè)原始胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）。發(fā)育到第

4、4周，胚外外胚層誘導(dǎo)臨近的上胚層內(nèi)產(chǎn)生原始生殖細(xì)胞(primordial germ cell，PGC)。遷移入生殖嵴后的PGC，開(kāi)始了性別的分化。胚胎生殖細(xì)胞具有多能性，細(xì)胞標(biāo)記與ES細(xì)胞幾乎是一致的，堿性磷酸酶染色和Oct4表達(dá)均呈陽(yáng)性，通常用此標(biāo)記檢測(cè)小鼠體內(nèi)組織中特化的PGC。
　　 在胚胎6.25d，Vasa是生殖細(xì)胞特異的三磷酸腺(ATP)依賴(lài)的RNA解旋酶，Vasa編碼的RNA結(jié)合蛋白定位于胞質(zhì)，在生殖嵴區(qū)域的PGC

5、中表達(dá)，是遷移后期進(jìn)入性腺的生殖細(xì)胞包括生殖母細(xì)胞特異性標(biāo)記基因。Vasa基因在卵巢和睪丸組織中表達(dá)，成體組織中檢測(cè)不到，是生殖細(xì)胞分化的高度特異性標(biāo)志。到目前為止，Vasa是唯一對(duì)于生殖細(xì)胞系完全特異的，大多數(shù)種屬細(xì)胞中Vasa表達(dá)出現(xiàn)即代表生殖細(xì)胞特化。組織非特異堿性磷酸酶(tissuenon-specificalkaline phosphatase，TNAP)作為PGC的標(biāo)志物，可監(jiān)測(cè)PGC由尿囊到生殖嵴的遷移過(guò)程。在精子和卵細(xì)胞

6、形成過(guò)程中，Stra8調(diào)節(jié)減數(shù)分裂起始，減數(shù)分裂是通過(guò)RA誘導(dǎo)的Stra8實(shí)現(xiàn)的。
　　 干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的方法大致有3種:
　　 ①培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)分化因子，目前使用最多最廣泛;
　　 ②與希望誘導(dǎo)分化的目的細(xì)胞共培養(yǎng);
　　 ③目的基因轉(zhuǎn)染，使擬誘導(dǎo)分化的細(xì)胞表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)是在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑維甲酸和睪酮對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。維甲酸是配子形成的一個(gè)基本調(diào)節(jié)者。人們已經(jīng)很確定的是，維甲

7、酸是由飲食維生素A合成的，是雌雄配子進(jìn)入減數(shù)分裂所需要的，維生素A的缺乏會(huì)導(dǎo)致這個(gè)過(guò)程的停止。雌鼠的性腺性別被決定后減數(shù)分裂很快被發(fā)起，由于減數(shù)分裂是通過(guò)RA誘導(dǎo)的Stra8實(shí)現(xiàn)的，這種發(fā)起會(huì)被RA拮抗物或是敲去Stra8所阻斷。Stra8主要在減數(shù)分裂前生殖細(xì)胞中表達(dá)，一旦進(jìn)入減數(shù)分裂，Stra8mRNA水平在生殖細(xì)胞中大大降低或消失。睪酮是由睪丸分泌的一種類(lèi)固醇激素，是人體內(nèi)主要的雄激素，與男性第二性征的發(fā)育有關(guān)，在精子發(fā)生過(guò)程中具

8、有重要作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)基于筋膜學(xué)理論，研究探索脂肪源干細(xì)胞是否在體外誘導(dǎo)情況下具有向生殖系分化潛能，即在體外誘導(dǎo)情況下，觀察是否能檢測(cè)出生殖系特異性基因的表達(dá)。
　　 目的:
　　 MSCs的多組織來(lái)源性，與筋膜結(jié)締組織支架的全身分布性具有一致性，其橫向、縱向分化的生物學(xué)特性，與筋膜結(jié)締組織對(duì)機(jī)體的支持儲(chǔ)備作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干細(xì)胞的一種儲(chǔ)備形式。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠筋膜結(jié)締組織皮下脂肪作為組織

9、來(lái)源，分離培養(yǎng)ADSCs，并對(duì)其表型鑒定，探討筋膜結(jié)締組織中對(duì)機(jī)體產(chǎn)生支持儲(chǔ)備作用的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ);研究ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下是否能表達(dá)生殖細(xì)胞相關(guān)基因Stra8，Vasa，Oct4，Dazl，Nobox和Piwil，進(jìn)而判斷ADSCs是否具有向生殖細(xì)胞分化的潛能;研究在睪酮和維甲酸單獨(dú)和聯(lián)合誘導(dǎo)下，ADSCs細(xì)胞周期的變化，進(jìn)而判斷睪酮和維甲酸對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　 1通過(guò)細(xì)胞分離培養(yǎng)判斷非特異性筋膜結(jié)締組織中是否存在未分化的

10、間充質(zhì)干細(xì)胞，以及這種干細(xì)胞的相關(guān)特性;
　　 2、通過(guò)RT-PCR技術(shù)觀察ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下是否能表達(dá)生殖細(xì)胞相關(guān)基因Stra8和Vasa，進(jìn)而判斷ADSCs是否具有向生殖細(xì)胞分化的潛能;
　　 3、通過(guò)定量PCR技術(shù)觀察ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下是否能表達(dá)生殖細(xì)胞相關(guān)基因Oct4，Dazl，Nobox，Piwil及表達(dá)量，進(jìn)而判斷ADSCs是否具有向生殖細(xì)胞分化的潛能;
　　 4、探索在睪酮和維甲酸單獨(dú)和

11、聯(lián)合誘導(dǎo)下，ADSCs細(xì)胞周期的變化，進(jìn)而判斷睪酮和維甲酸對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　 方法:
　　 1、取2月齡SD雌性大鼠腹股溝部皮下脂肪組織，采用酶消化法分離、培養(yǎng)脂肪源干細(xì)胞。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)鑒定非特異性筋膜結(jié)締組織中的脂肪源干細(xì)胞是否符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性以及部分表面標(biāo)記，以驗(yàn)證非特異性筋膜結(jié)締組織中是否含有間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2、將第四代ADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)和成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，分別

12、進(jìn)行相應(yīng)的茜素紅和油紅O染色，以鑒定ADSCs的分化潛能。同時(shí)取培養(yǎng)的第四代ADSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)部分表面抗原，證明ADSCs干細(xì)胞特性。
　　 3、取培養(yǎng)的第四代ADSCs的總RNA進(jìn)行RT-PCR，用微量酶標(biāo)儀檢測(cè)原始生殖細(xì)胞標(biāo)記非特異性堿性磷酸酶;分別檢測(cè)維甲酸誘導(dǎo)前后細(xì)胞中Stra8和Sasa的表達(dá)，以睪丸細(xì)胞中的Stra8和Vasa的表達(dá)作陽(yáng)性對(duì)照。
　　 4、取培養(yǎng)的第四代ADSCs分:
　　

13、①對(duì)照組（不加任何誘導(dǎo)劑）;
　　 ②10-5mol/L RA誘導(dǎo)2周;
　　 ③10-5mol/L RA誘導(dǎo)4周;
　　 ④10-6mol/L RA誘導(dǎo)2周;
　　 ⑤10-6mol/LRA誘導(dǎo)3周;
　　 ⑥10-6mol/LRA誘導(dǎo)4周。
　　 然后分別檢測(cè)各組中生殖細(xì)胞相關(guān)基因Oct4，Dazl，Nobox，Piwil的表達(dá)。
　　 5、取培養(yǎng)的第四代ADSCs分:

14、　　 ①對(duì)照組（不加任何誘導(dǎo)劑）;
　　 ②10-5mol/L RA組;
　　 ③10-6mol/L RA組;
　　 ④10-5mol/L RA+睪酮組;
　　 ⑤10-6mol/LRA+睪酮組;
　　 ⑥睪酮組。
　　 各組培養(yǎng)36小時(shí)后行流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞分期的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、光學(xué)顯微鏡下觀察貼壁ADSCs形態(tài)多呈梭形、多邊形，細(xì)胞大小均勻;

15、　　 2、流式細(xì)胞術(shù)鑒定ADSCs的表面抗原顯示CD29、CD90、CD106呈陽(yáng)性，CD11b、CD45、CD49d呈陰性;
　　 3、ADSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，油紅O染色顯示特異性脂滴，而陰性對(duì)照孔中未觀察到紅染的脂滴。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)呈特異性的粉紅色，陰性對(duì)照孔中未見(jiàn)被染成粉紅色的鈣結(jié)節(jié);
　　 4、微量酶標(biāo)儀檢測(cè)顯示ADSCs經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)后堿性磷酸酶的表達(dá)顯著增高，將ADSC

16、s分別用10-5mol/L，10-6mol/L，10-7mol/L RA誘導(dǎo)7d的OD值分別為0.585±0.04，0.268±0.07，0.151±0.03，對(duì)照組為0.068±0.01，誘導(dǎo)14 d的OD值分別為0.417±0.02，0.341±0.01，0.187±0.02，對(duì)照組為0.067±0.01，說(shuō)明RA能顯著性促進(jìn)ADSCs堿性磷酸酶的表達(dá)(P＜0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示ADSCs中RA誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后均不表達(dá)str

17、a8和vasa，陽(yáng)性對(duì)照組睪丸細(xì)胞中可表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)記基因stra8和vasa;
　　 5、定量PCR結(jié)果顯示，ADSCs經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)后能夠表達(dá)oct4，dazl，nobox，piwil四個(gè)基因，oct4，dazl，nobox的表達(dá)規(guī)律較為一致，均在10-6mol/L RA誘導(dǎo)3周時(shí)表達(dá)量最高，piwil在10-6mol/L RA誘導(dǎo)4周時(shí)表達(dá)量最高;
　　 6、流式細(xì)胞術(shù)顯示，各組G1期的細(xì)胞比例分別為80.3％，82

18、.0％，85.2％，81.0％，65.1％，68.5％，各組S期的細(xì)胞比例分別為14.7％，12.7％，9.2％，13.5％，28.6％，22.7％。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過(guò)本實(shí)驗(yàn)筆者認(rèn)為在發(fā)育成熟大鼠的筋膜結(jié)締組織的脂肪中存在多能干細(xì)胞，而且可通過(guò)消化-貼壁-傳代的程序分離得到這些ADSCs;為筋膜結(jié)締組織對(duì)機(jī)體發(fā)揮著支持與儲(chǔ)備作用（干細(xì)胞儲(chǔ)備）提供實(shí)驗(yàn)支持，即筋膜結(jié)締組織中的ADSCs為機(jī)體損傷修復(fù)提供細(xì)胞來(lái)源

19、。
　　 2、ADSCs具有成體間充質(zhì)干細(xì)胞特性，具有多向分化潛能，經(jīng)定向誘導(dǎo)培養(yǎng)后可向成骨和成脂分化。
　　 3、ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下能夠表達(dá)原始生殖細(xì)胞標(biāo)記堿性磷酸酶，但用10-5mol/L維甲酸誘導(dǎo)7d不能表達(dá)生殖標(biāo)記基因Stra8和Vasa，睪丸細(xì)胞中表達(dá)生殖標(biāo)記基因Stra8和Vasa。
　　 4、在維甲酸誘導(dǎo)下ADSCs能夠表達(dá)生殖細(xì)胞相關(guān)基因Oct4，Dazl，Nobox，Piwil，表明ADS

20、Cs在維甲酸誘導(dǎo)下具有向生殖細(xì)胞方向分化的潛在能力。
　　 5、維甲酸能夠抑制脂肪源干細(xì)胞的增殖，睪酮?jiǎng)t能夠促進(jìn)脂肪源干細(xì)胞的增殖。
　　 綜上所述，本研究分別采用了細(xì)胞分離培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)，成脂成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及檢測(cè)等技術(shù)手段，從ADSCs形態(tài)特征，成脂、成骨誘導(dǎo)、表面標(biāo)志等方面探討ADSCs。證實(shí)在成熟大鼠的結(jié)締組織中存在間充質(zhì)干細(xì)胞，提示分布于全身的筋膜結(jié)締組織支架很可能就是機(jī)體內(nèi)在的“干細(xì)胞庫(kù)”。這種干細(xì)胞易于分離培

21、養(yǎng)，具有良好的增殖、分化能力。筆者認(rèn)為ADSCs是筋膜中間充質(zhì)干細(xì)胞的一種儲(chǔ)備形式，更重要的是筋膜結(jié)締組織對(duì)機(jī)體的支持與儲(chǔ)備起著細(xì)胞儲(chǔ)備作用，為機(jī)體損傷修復(fù)提供干細(xì)胞支持。
　　 通過(guò)微量酶標(biāo)儀檢測(cè)，ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下原始生殖細(xì)胞標(biāo)記堿性磷酸酶的表達(dá)顯著升高，通過(guò)RT-qPCT技術(shù)檢測(cè)證實(shí)ADSCs用10-5mol/L維甲酸誘導(dǎo)7d不能表達(dá)生殖標(biāo)記基因Stra8和Vasa，在維甲酸誘導(dǎo)下ADSCs能夠表達(dá)生殖細(xì)胞相關(guān)基因O