1、研究背景:肩袖損傷后，其腱骨愈合受到多方面因素的影響，包括機械應力、炎癥反應和細胞因子等很多方面，腱骨界面(BTJ)常常被認為是關節(jié)損傷修復早期的薄弱點。臨床資料顯示，外科手術修補后的肩袖以瘢痕重塑的形式愈合，由多種炎癥因子和生長因子參與修復重建過程。這種非完全重建式的愈合使得肩袖組織的生物力學強度遠遠低于正常水平，最終結果往往導致術后肩袖再撕裂的發(fā)生。TGF-β1是促使BTJ愈合中瘢痕形成的關鍵因子，前人研究發(fā)現，通過抑制TGF-β1

2、/Smad信號通路可以抑制瘢痕增生。在此基礎上，本研究擬構建SD大鼠岡上肌BTJ損傷的修復模型，在體研究TGF-β1及Smad在其愈合過程中的分布與瘢痕形成的相關性;分別在愈合與重塑的不同時期，用針對沉默TGF-β1、Smad蛋白家族設計的慢病毒感染BTJ，抑制TGF-β1/Smad信號通路，觀察抑制后的BTJ細胞和細胞外基質的變化及相關生物學、生物力學的改變，探究此信號通路對肩袖BTJ愈合的調節(jié)機制，為臨床治療提供新思路。
　　

3、研究目的:本課題擬通過構建SD大鼠單側岡上肌損傷修復模型，在體研究TGF-β1及Smad在其愈合過程中的分布與瘢痕形成的相關性;分別在愈合與重塑的不同時期，用針對沉默TGF-β1、Smad蛋白家族表達的慢病毒感染BTJ，抑制TGF-β1/Smad信號通路，觀察抑制后的BTJ細胞和細胞外基質的變化及相關生物學、生物力學的改變，探究此信號通路對肩袖BTJ愈合的調節(jié)機制。
　　研究方法:
　　1、實驗設計:選取雄性SD大鼠50只（

4、第二軍醫(yī)大學動物實驗中心提供），體重(150-200)g，其中10只不做手術處理作為①空白對照組。剩余40只模擬行單側（左上肢）岡上肌肩袖組織撕裂修補術，術后平均分為4組，在術后3d、5d、10d在岡上肌肩袖局部分別給予不同藥物注射處理，根據注射藥物的不同分為②生理鹽水對照組、③TGFβ1抑制組、④Smad2抑制組、⑤TGFβ1/Smad2共同抑制組，藥物注射治療后分別在第7d、14d、21d、28d各處死2只SD大鼠，留取左上肢岡上肌

5、局部標本，進行生物力學檢測和組織學、免疫組化觀察，評估肩袖愈合效果。
　　2、模型制備的手術方法:SD大鼠采用10％水合氯醛生理鹽水溶液（按照體重標準0.4ml/500g）腹腔注射麻醉，麻醉完成后，在固鼠板上用皮筋固定大鼠四肢（俯臥位固定），用剃毛器刮凈左上肢局部毛發(fā)，用1％醫(yī)用碘伏消毒備皮區(qū)，鋪無菌單?？v行切開皮膚，長約3-4cm，分離淺筋膜至暴露肩胛區(qū)及上臂肌肉，找到斜方肌附著部，沿斜方肌境界輕柔切開此肌肉，向前上方翻開即可見

6、岡上肌正位于斜方肌覆蓋之下。仔細分離整條岡上肌至肱骨大結節(jié)止點，切斷少許三角肌充分暴露岡上肌在肱骨大結節(jié)的附著部位，鈍性撕脫岡上肌在肱骨大結節(jié)處的附著，用巾鉗在肱骨大結節(jié)上建立骨隧道，方向與岡上肌在骨質表面的附著走形一致，再用不可吸收縫線分別在岡上肌組織末端間隔1.5-2mm縫合組織，并將縫線穿過骨道打結固定，將岡上肌腱縫合在原來的足印區(qū)，建立SD大鼠單側岡上肌損傷修復模型備用。
　　3、分階段抑制TGFβ1/Smad信號通路

7、r>　　1)針對TGFβ1、Smad2的siRNA的設計、合成和篩選根據siRNA設計原理和要求，針對SD大鼠TGFβ1、Smad2基因序列特征，為每個基因分別設計合成三對熒光報告基因標記siRNA;脂質體包裹siRNA，以相同濃度，相同作用時間轉染SD大鼠成纖維細胞;Rt-PCR，Western Blot篩選高效特異的siRNA;確定最佳轉染濃度和時間。
　　2) TGFβ1、Smad2的慢病毒感染效果及評價根據siRNA的位點

8、序列合成相應的shRNA質粒，并包裝出相應的慢病毒，感染大鼠成纖維細胞驗證其對靶基因的抑制效率
　　3)分階段抑制注射在BTJ愈合和重塑的不同階段，注射慢病毒抑制TGFβ1/Smad通路，術后3d、5d、10d連續(xù)給藥3次，注射慢病毒感染大鼠單側（左上肢）BTJ部位。
　　4、取材及制作標本:藥物注射治療后每組分別在第7d、14d、21d、28d各處死2只SD大鼠，留取左上肢岡上肌局部標本，進行生物力學檢測和組織學、免疫組化

9、觀察，評估肩袖愈合效果;切取肩胛骨及與其相連的肱骨為一個完整部位行生物力學抗拉力測試，同時取1只正常組大鼠的左側BTJ樣本為對照。生物力學測試完成后的標本，取大結節(jié)足印區(qū)的組織(厚約5mm)進行脫鈣固定留備，染色、免疫組化檢測，比較愈合過程不同時間BTJ中瘢痕組織的形成和轉歸的特點，以及纖維軟骨的分布及其與正常BTJ的差別。
　　5、觀察方法和結果測定:生存狀態(tài)觀察:首先在取材之前對于不同實驗組的SD大鼠，比較其在術前、術后不同時

10、間節(jié)點的生存狀態(tài)，比如動物活動狀態(tài)、手術切口愈合情況（有無感染等炎癥反應）、肢體活動度等等。
　　HE染色觀察:組織經過固定、脫鈣、脫水、清洗、包埋、切片和染色，可見細胞核呈藍色，細胞質呈淡紅色。
　　Masson三色法染色觀察:膠原纖維呈藍色，肌纖維、細胞質、纖維素、角蛋白和紅細胞呈紅色，細胞核呈藍褐色。
　　6、統計學分析:各組動物之間在各時間點的生物力學數據統計學分析采用SNK-q檢驗(Student-Newma

11、n-Keuls test)，以明確各組之間各個時間節(jié)點的腱骨愈合是否存在差異。
　　研究結果:
　　1、大體結果:手術組與非手術組對比:手術組動物在術后出現活動度減退，肢體活動度受限的情況，影響大鼠行走步態(tài)（跛行或者拖行），部分出現傷口崩裂、局部組織感染化膿（感染率為20％）;飲食無明顯變化;手術組動物易激惹。接受手術的動物，不同給藥治療組之間的比較:大鼠生存狀態(tài)無明顯異常，感染率無明顯差別(20％)。
　　2、組織切

12、片染色結果
　　1)手術組動物(②③④⑤)肩袖BTJ最終達到瘢痕愈合;局部瘢痕生成的量有所不同;
　　2)⑤組動物最終愈合結果的瘢痕與②③④組比較明顯減少，愈合效果最好，肉眼觀察有差異;②③④組間結果比較，在肉眼下觀察無明顯差異，BTJ處有較多的瘢痕組織及雜亂的新生膠原纖維;
　　3)成纖維細胞含量:①空白對照組45％;②生理鹽水對照組78％;③TGF-β1抑制組70％;④Smad2抑制組75％;⑤TGF-β1/Sma

13、d2共抑制組50％。
　　3、免疫熒光、Rt-PCR、Western Blot檢測結果
　　1)細胞基質成分中Aggrecan、Biglycan、Elastin、Tenascin-C的含量在③④⑤組均有升高，⑤組升高最明顯;
　　2)基質酶的改變中，MMP在③④⑤組均呈降低趨勢，在第②組呈增高趨勢，TIMP的變化趨勢與MMP相反;
　　3) COX酶含量的化各不相同，各組之間無可比性;
　　4)轉錄因子SO

14、X9的含量與第①組相比在②③④⑤組呈增高趨勢，各組之間無明顯差異;
　　5)凋亡相關因子p53,NF-κB，熱休克蛋白的變化③④⑤組總體呈降低趨勢，⑤組最明顯;而第②組結果與其他相反，呈上升趨勢，提示有組織退變的可能。
　　4、生物力學檢測結果:肩袖愈合的總體趨勢隨著時間的推移體現為腱骨愈合部位的終末拉力值的增強，其中，第⑤組的終末抗拉力結果優(yōu)勢最明顯。同一時間節(jié)點，各分組生物力學數據樣本均數兩兩之間的全面比較比較采用SNK

15、-q檢驗(Student-Newman-Keuls test)，按照α=0.05水準:第⑤組與②③④組在各時間節(jié)點數據比較均有統計學意義;第①組與②③④組在前3周數據比較有統計學意義，最后一周數據之間無統計學意義;第①組與第⑤組之間在最后一周數據相比有統計學意義，前三周數據相比無明顯統計學意義;②③④三組之間各時間節(jié)點數據比較，無明顯統計學差異。
　　研究結論:單側SD大鼠岡上肌損傷修復模型具有易操作、成功率高、可重復性好、模型動

16、物生存質量穩(wěn)定、取材方便等方面的優(yōu)點，是研究肩袖病變發(fā)病機制的良好模型;HE染色是組織切片常用的染色方法，操作簡便，可以大體觀察到BTJ的組織層次，初步評價愈合效果;Masson染色可以特異性的觀察膠原纖維的分布，有助于評價肩袖愈合的效果;免疫組化、Rt-PCR和Western Blot對于生長因子，蛋白、酶類以及信號通路上的其他物質的變化可以檢測的更為精確，發(fā)現信號通路抑制后愈合過程中物質含量的變化，為進一步揭示其作用機制提供了依據。