1、1、研究背景
　　肺癌嚴重危害人類生命健康，目前為我國惡性腫瘤死因的第一位，且其發(fā)病率仍在不斷提高。原發(fā)性中央型氣道非小細胞肺癌是指原發(fā)于氣管、主支氣管和右中間段支氣管的非小細胞性惡性上皮性腫瘤，與其他部位肺癌相比，該類腫瘤在病理組織學特征、臨床特點、中醫(yī)證候分布等方面尚不明確，從而給本疾病的中醫(yī)、西醫(yī)治療治療造成困難。前期的預實驗結果發(fā)現(xiàn)，中央型氣道非小細胞肺癌中，涎腺型癌占很高的比例，這不僅給西醫(yī)的病理診斷造成極大困難，同時也

2、為涎腺型癌的中醫(yī)證候研究帶來了新課題。因此，有必要對本組腫瘤進行系統(tǒng)的病理學分析、組織學鑒別診斷、中醫(yī)證候分析、化療及預后指標研究等，以期全面地了解其西醫(yī)分類和中醫(yī)證候的特點及內在聯(lián)系，為更有針對性地進行中西醫(yī)治療提供理論基礎。本課題獲得北京中醫(yī)藥大學中青年教師課題資助。
　　2、研究目的
　　通過對一組中央型氣道非小細胞肺癌進行經(jīng)典病理學、中醫(yī)辨證分型、免疫組織化學及分子病理學研究，達到以下目的:①闡明中央型氣道非小細胞肺

3、癌的臨床病理特點，為西醫(yī)治療方案的選擇提供指導;②系統(tǒng)研究和探討中央型氣道非小細胞肺癌中醫(yī)證候的分布情況，確立其與病理組織學、臨床特征、腫瘤TNM分期等的相關性，為今后更好地指導中央型氣道非小細胞肺癌的中西醫(yī)結合治療提供參考依據(jù);③找到一個簡單、高效及最優(yōu)化的抗體組合，用以鑒別中央氣道型肺癌的不同組織學類型，包括鱗癌、腺癌、腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌、肌上皮癌、涎腺腺癌（非特指）等;④探討ERCC1、Beta-tubulin這兩種與化療藥

4、物選擇、估計預后相關指標在中央型氣道非小細胞肺癌中的表達，以及與不同中醫(yī)證候的關系;⑤通過研究中央型氣道非小細胞肺癌不同組織學類型中ALK基因異常情況，探討克唑替尼等靶向藥物用于本組病人治療的可能性。
　　3、研究對象
　　研究對象為病理學診斷證實的肺原發(fā)性非小細胞肺癌，臨床分期為Ⅲ期及Ⅳ期的患者，病變部位為中央型氣道;病例來源為2013年6月至2014年5月間北京煤炭總醫(yī)院腫瘤微創(chuàng)治療中心收治的支氣管鏡介入性治療的肺癌患者

5、，治療時收集其切除的腫瘤標本，并收集其臨床資料;共收集符合入組標準的109例病人的標本，其中男性91例，女性18例，年齡最小29歲，最大者86歲，中位年齡62歲。
　　4、研究內容及方法
　　4.1研究內容
　?、僦醒胄蜌獾婪切〖毎伟┑牟±斫M織學類型及臨床特點;②中央氣道型非小細胞肺癌的中醫(yī)證候分布特征，以及與病理組織學、TNM分期等的關系;③優(yōu)化免疫組化抗體組合，以鑒別不同組織學類型的中央型氣道非小細胞肺癌;④ER

6、CC1、Beta-tubulin在中央型氣道非小細胞肺癌中的表達規(guī)律，以及與中醫(yī)證候的關系;⑤ALK基因的異常改變情況。
　　4.2研究方法
　　4.2.1中醫(yī)證候判定及臨床數(shù)據(jù)采集
　　中醫(yī)證候標準根據(jù)2002版《中藥新藥臨床研究指導原則》。TNM分期根據(jù)2009年AJCC第7版非小細胞肺癌分期標準。通過查閱文獻，設計詳細的CRF表，從病人的病歷記錄中提取基礎數(shù)據(jù)資料，對所有的病人進行床旁深度訪談問診及體格檢查，以確

7、定病人的中醫(yī)證候;所有入組的病人均有病理組織學診斷證實，凡不符合要求者隨后剔除，不納入本研究。
　　4.2.2組織處理及病理學診斷
　　肺癌的組織學診斷標準根據(jù)2004WHO肺癌腫瘤分類以及2011年IASLC/ATS/ERS肺腺癌分類標準。標本經(jīng)中性緩沖福爾馬林固定8～72小時，自動脫水機脫水，常規(guī)石蠟包埋;制備厚度4微米連續(xù)切片，用于HE染色及免疫組化染色;使用全自動組織芯片儀制作組織芯片，用于免疫組化染色。所有切片均由

8、2名高級職稱病理醫(yī)師分別雙盲組織學觀察、免疫組化觀察及評分。對于診斷有分歧的病例則在多頭鏡下，共同協(xié)商確定組織學診斷及免疫組化評判。
　　4.2.3免疫組化染色及判斷標準
　　4.2.3.1 ALK-D5F3
　　ALK-D5F3工作液，使用Ventana全自動免疫組化染色機染色。陽性者為腫瘤細胞中存在強的顆粒狀胞漿染色，排除已知的染色因素，包括肺泡巨噬細胞胞漿中較淡的點彩狀染色、神經(jīng)纖維及神經(jīng)節(jié)細胞、浸潤的淋巴細胞、

9、壞死物及粘液等;ALK-D5F3陰性對照:腫瘤細胞內不存在強的顆粒狀胞漿染色。
　　4.2.3.2 p63
　　p63原液，1∶200稀釋度，使用Ventana全自動免疫組化機染色。P63陽性染色定義為明確的核著色，p63表達陽性標準為陽性細胞數(shù)目≥10％全部腫瘤細胞數(shù)。同時觀察p63陽性細胞分布特點，分為兩種:彌漫性及癌巢周邊部“鑲邊狀”分布。
　　4.2.3.3 p40
　　p40鼠單抗原液，1∶200稀釋度

10、，使用Ventana全自動免疫組化機染色。p40染色與p63相同，為核陽性著色，p40表達陽性病例判斷標準為陽性細胞數(shù)≥10％者。記錄陽性細胞分布特點，分為兩種:彌漫性及癌巢周邊部分布。
　　4.2.3.4 TTF-1
　　TTF-1鼠單抗原液，1∶200稀釋度，使用Ventana全自動免疫組化機染色。TTF-1為核陽性著色。陽性細胞數(shù)≥10％者判斷為陽性，其余的為陰性。
　　4.2.3.5 Ki-67
　　Ki

11、-67克隆號MIB-1抗體原液，1∶200稀釋度，使用Ventana全自動免疫組化機染色。Ki-67為核陽性著色，計算方法為Ki-67指數(shù)，即核陽性細胞占所有腫瘤細胞的百分數(shù)。
　　4.2.3.6 SMA
　　SMA單抗原液1∶100稀釋度，使用前述手工免疫組化染色流程，陽性著色表現(xiàn)為胞漿內較強的棕黃色著色。對于陽性者，同時觀察其細胞分布特點，包括彌漫性分布或在腫瘤細胞巢周圍環(huán)繞狀分布。
　　4.2.3.7 ERCC1

12、
　　ERCC1鼠單抗原液，稀釋度1∶300，使用前述手工免疫組化染色流程，陽性著色為核陽性著色。ERCC1核表達分為四級:無任何陽性細胞或＜10％陽性，得分為0;＞10％核隱隱/幾乎難以察覺的部分腫瘤細胞表達者，得分1+;＞10％腫瘤細胞核呈中等強度染色得分2+;＞10％腫瘤細胞核呈強陽性染色，得分3+。本研究采用兩級標準:2+或3+分為陽性，0分或1+為陰性。
　　4.2.3.8 Beta-tubulin
　　Be

13、ta-tubulin鼠單抗原液，稀釋度1∶100，使用前述手工免疫組化染色流程，陽性著色為胞漿棕黃色著色。Beta-tubulin表達評分為為4級，胞漿無著色者為0分;較弱的剛剛能觀察到的＜10％的腫瘤細胞胞漿著色為1+;＞10％腫瘤細胞弱到中等強度著色為2+;＞10％腫瘤細胞強胞漿著色為3+;本研究采用兩級分類標準，0和1+為陰性，2+及3+為陽性。
　　4.2.4 ALK-FISH
　　商用的ALK基因的斷裂-分離雙色探

14、針按照制造商的說明進行染色。該5'ALK探針標記SpectrumGreen，3'ALK探針標記SpectrumOrange。染色在組織芯片的石蠟切片上進行。用熒光顯微鏡在100X油鏡下，每例觀察至少100個非重疊的細胞內的雜交信號。ALK-FISH陽性的標準為100個分析細胞中，大于等于15個細胞顯示ALK基因的熒光探針的側面分離，紅綠信號分離的距離超過2個信號直徑。如果陽性細胞數(shù)介于5～15之間，則需另外計數(shù)100個細胞，若大于等于1

15、5個陽性細胞，仍可視為ALK FISH陽性。
　　4.2.5統(tǒng)計分析
　　使用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件，計數(shù)資料使用非參數(shù)的卡方檢驗，計量資料使用t檢驗，方差不齊時使用秩和檢驗。
　　5、研究結果
　　5.1中央型氣道非小細胞肺癌的病理及臨床特點
　　5.1.1病理組織學類型的構成，鱗癌69例，占63.3％，涎腺型癌27例，占24.8％，腺癌10例，占9.2％，其他的腺鱗癌2例、癌肉瘤1例。涎腺型癌中，腺

16、樣囊性癌最多見，占55.6％，肌上皮癌占22.2％，涎腺腺癌（非特指）占14.8％，其中肌上皮癌有涎腺腺癌（非特指）為罕見的原發(fā)于肺的涎腺型癌。
　　5.1.2臨床病理特點:老年、男性、吸煙病人以鱗癌為主;年輕、女性、不吸煙病人以涎腺型癌為主。
　　5.2中央型氣道非小細胞肺癌的中醫(yī)證候及分布特點
　　5.2.1本組共109例肺癌中，氣虛痰濕證36例，陰虛熱毒證12例，氣陰兩虛證40例，氣血瘀滯證21例;從其分布特點來

17、看，鱗癌及涎腺型癌患者中，以氣陰兩虛證為最多見，分別占41.4％及40.7％;腺癌中以氣虛痰濕證為最多見，占50％。
　　5.2.2中醫(yī)證候與年齡、性別、吸煙史及卡氏評分等均相關，老年病人、男性、有吸煙史、卡氏評分高于60分者，均以氣陰兩虛證為主;而年輕病人、女性、無吸煙史、卡氏評分低于60分者，多以氣虛痰濕證候為主。
　　5.3免疫組化鑒別診斷及與中醫(yī)證候的關系
　　5.3.1 p63
　　不同中醫(yī)證候間p63

18、陽性表達率有極顯著性差異(P＜0.01)，其中在氣陰兩虛證候中陽性率為97.5％，而在陰虛熱毒證病人中陽性率較低，約66.7％。p63在不同病理組織學類型癌中表達有極顯著性差異(P＜0.01)，其中在鱗癌中的表達率100％，腺癌中無一例陽性表達，涎腺型癌中陽性率約81.5％。p63在鱗癌、肌上皮癌中呈彌漫性/彌散性表達，但在腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌中，呈癌巢周圍“鑲邊狀”分布。彌漫性p63陽性對于診斷鱗癌的敏感性為100％，特異性為82

19、.5％; p63“鑲邊狀”陽性對于腺樣囊性癌和粘液表皮樣癌診斷的特異性及敏感性均為100％。
　　5.3.2 p40
　　不同中醫(yī)證候間p40陽性表達率有極顯著性差異(P＜0.01)，其中氣陰兩虛證陽性率高(97.5％)，而陰虛熱毒證病人陽性率較低(58.3％)。p40在不同病理組織學類型癌中表達有極顯著性差異(P＜0.01)，其中在鱗癌中的表達率100％，腺癌中無一例陽性表達，涎腺型癌中陽性率約77.8％。p40在鱗癌、肌

20、上皮癌中呈彌漫性/彌散性表達，但在腺樣囊性癌、粘液表皮樣癌中，呈癌巢周圍“鑲邊狀”分布。彌漫性p40陽性對于診斷鱗癌的敏感性為100％，特異性為90.0％; p40“鑲邊狀”陽性對于腺樣囊性癌和粘液表皮樣癌診斷的特異性及敏感性均為100％。
　　5.3.3 TTF-1
　　TTF-1在鱗癌無一例表達，腺癌陽性率為50％，涎腺型癌有2例個別細胞陽性，但＜10％，未達到陽性標準;TTF-1對腺癌診斷的敏感性為50％，特異性為10

21、0％。
　　5.3.4 SMA
　　SMA在鱗癌及腺癌中無一例表達。在肌上皮癌中，呈彌漫性陽性表達(100％)，在腺樣囊性癌中，為癌巢周圍“鑲邊狀”陽性表達，陽性率93.3％。“鑲邊狀”SMA陽性對腺樣囊性癌+粘液表皮樣癌診斷的敏感性為94.1％，特異性為100％。
　　5.3.5 Ki-67
　　Ki-67指數(shù)在涎腺型癌與非涎腺型癌兩組之間比較有極顯著性差異，涎腺型癌的Ki-67指數(shù)平均數(shù)顯著低于非涎腺型癌者。

22、
　　5.3.6 ERCC1與Beta-tubulin
　　ERCC1陽性率在不同中醫(yī)證候病例間有極顯著性差異(P＜0.01)，在氣虛痰濕證及氣血瘀滯證中陽性率較高，而在陰虛熱毒證中表達較低。
　　Beta-tubulin陽性率在不同病理組織學類型間有極顯著性差異(P＜0.01)，在腺癌中陽性率較高，而在涎腺型癌中表達較低。
　　5.4 ALK免疫組化及ALK-FISH
　　通過免疫組化和FISH的方法，共

23、檢測出3例ALK陽性肺癌，其中腺癌2例，占20％，鱗癌1例，占1.45％。
　　6、結論
　　6.1明確了中央型氣道非小細胞肺癌的中醫(yī)證候分布及臨床特征:男性、吸煙、鱗癌病人多為氣陰兩虛證，女性、不吸煙、涎腺型癌/腺癌病人，多為氣虛痰濕證或陰虛熱毒證。
　　6.2 ERCC1在氣虛痰濕證及氣血瘀滯證中陽性率高，在陰虛熱毒證中表達較低;Beta-tubulin在腺癌中表達最高，其次是鱗癌，在涎腺型癌中表達最低。ERCC1

24、及Beta-tubulin的表達檢測可為選擇化療藥物、判斷病人預后有參考價值。
　　6.3闡明了中央型氣道非小細胞肺癌有其獨特的臨床病理特點，包括:①主要由鱗癌、涎腺型癌、腺癌3種組織學類型;②涎腺型癌占很高的比例;③有肌上皮癌、涎腺腺癌（非特指）等少見類型;④老年、男性、吸煙病人以鱗癌為主;年輕、女性、不吸煙病人以涎腺型癌為主。
　　6.4證實了p40/TTF-1/SMA三種抗體作為高效的組合，可以鑒別中央型氣道非小細胞肺

25、癌的組織類型:①鱗癌:p40彌漫性/彌散性(+)，TTF-1(-)，SMA(-);②腺癌:p40陰性，TTF-1(+)或(-)，SMA（-）;③腺樣囊性癌/粘液表皮樣癌:p40及SMA癌巢周“鑲邊狀”(+)，TTF-1（-），個別散在弱(+);④肌上皮癌:SMA(+)，p40部分彌散性(+)，TTF-1（-）;⑤涎腺腺癌，非特指:p40陰性，SMA陰性，TTF-1(-);⑥p40對鱗癌診斷的特異性高于p63;⑦涎腺型癌的Ki-67指數(shù)低

26、于鱗癌及腺癌。
　　6.5中央型氣道腺癌、鱗癌均有ALK基因重排，適合選擇分子靶向藥物治療。涎腺型癌中未發(fā)現(xiàn)有ALK的基因重排異常。
　　7創(chuàng)新點
　　7.1首次以中央型氣道非小細胞肺癌為研究對象，闡明了不同不醫(yī)證候各自的組織學特點及臨床特征，從而為更有針對性地中西醫(yī)治療提供理論基礎;
　　7.2找到了一個最佳抗體組合，用以鑒別診斷中央型氣道非小細胞肺癌的各種組織學類型，并研究了ERCC1，Beta-tubuli