1、前言
　　類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫病。RA主要的病變位于關節(jié)滑膜,關節(jié)局部產(chǎn)生大量的細胞因子和趨化因子使滑膜炎癥持續(xù)存在,滑膜增生,血管翳形成,侵蝕破壞軟骨和骨組織,最終導致關節(jié)破壞和畸形。RA的發(fā)病機制仍未完全清楚,目前認為大量的活化的T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突細胞(dentritic cells,DC),相互活化,分泌細胞因子,是誘導RA自身免疫反應發(fā)生,導致關節(jié)滑膜炎癥

2、的關鍵因素。由于RA的發(fā)病機制尚不清楚,目前還沒有滿意的治療方法。臨床上用于治療RA的藥物包括甾體抗炎藥、非甾體抗炎藥、疾病調(diào)修藥、生物制劑以及天然藥物等。近年來,具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性的天然藥物及其有效成分,已經(jīng)成為治療RA新藥研發(fā)的熱點。人參皂苷CK(Ginsenoside Compound K,CK),屬于二醇型人參皂苷,為天然二醇型人參皂苷如人參皂苷Rb1、Rb2、Rc等在人腸道內(nèi)的主要降解產(chǎn)物,是人參皂苷在體內(nèi)吸收和發(fā)揮活性作

3、用的主要形式。文獻報道人參皂苷以及CK可抑制炎性細胞因子的分泌,提示CK具有一定的抗炎作用。然而CK對實驗性關節(jié)炎是否具有治療作用,以及抗炎免疫調(diào)節(jié)作用機制不清楚。本研究觀察了CK對實驗性關節(jié)炎的治療作用,以及對免疫細胞(T細胞、B細胞、巨噬細胞和DC細胞)和成纖維樣滑膜細胞(fibroblast synoviocytes,FLS)的調(diào)節(jié)作用,明確CK對實驗性關節(jié)炎的治療作用,以及其發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的部分機制,為CK作為新型的治療R

4、A的藥物提供實驗依據(jù)。
　　目的:觀察CK對大鼠佐劑性關節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis,AA)的治療作用,以及對免疫細胞(T細胞、B細胞、巨噬細胞和DC細胞)和滑膜細胞的調(diào)節(jié)作用,明確CK對實驗性關節(jié)炎的治療作用及其發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的部分機制,為CK作為新型的治療RA的藥物提供實驗依據(jù)。
　　方法:將10mg/ml弗氏完全佐劑(complete Freund adjuvant,CFA)充分混勻

5、,于每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射CFA0.1 ml,制備大鼠AA模型。正常組用生理鹽水同法注射。CK(5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)每天一次灌胃給藥(intragastric administration,ig)(d15~d29),觀察大鼠全身關節(jié)炎評分,關節(jié)炎指數(shù),足爪腫脹數(shù)及足爪腫脹度;檢測脾臟和胸腺指數(shù),光學顯微鏡觀察踝關節(jié)和脾臟病理變化,并進行病理評分;3

6、H-TdR檢測T、B細胞和滑膜細胞增殖;流式細胞術檢測脾臟T細胞亞群包括初始T細胞亞群（CD4+CD62L+)、活化T細胞（CD4+CD25+)和調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Foxp3+,Treg);B細胞亞群包括記憶B細胞(CD45R+CD27+)和總B細胞（CD45R+IgM+)和T細胞上CD25的表達。ELISA檢測細胞因子白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necros

7、is factor,TNF-α)、γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、IL-4、IL-17、IL-10、IL-2、核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand,RANKL)和骨保護素(osteoprotegerin,OPG)水平,以及血清IgG1、IgG2a、抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic cirullinated peptide,CCP)抗體和

8、抗II型膠原(CⅡ)抗體水平。DBA/1小鼠的尾根部皮內(nèi)注射CII乳劑誘導膠原性關節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)模型,流式細胞術檢測淋巴結樹突細胞(dedritic cells,DC)亞群包括單核細胞源性DC（monocyte-derived dedritic cells,mo-DC)(CD11b+CD209+)、漿細胞樣DC(plasmacytoid dendritic cells,pDC)(CD

9、11c+PDCA-1+)和初始T細胞亞群(CD4+CD62L+),以及DC上CD80、CD86、MHCⅡ、CCR7的表達;ELISA檢測淋巴結CCL21水平;transwell檢測DC的遷移,混合淋巴細胞反應檢測DC活化T細胞的能力。
　　結果:
　　1.CK可以減輕AA大鼠的關節(jié)炎癥狀,改善脾臟和關節(jié)病理,抑制滑膜細胞異常增殖和分泌。
　　CK(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、

10、160 mg/kg)可以不同程度的減輕AA大鼠的關節(jié)炎癥狀,包括降低關節(jié)炎全身評分和關節(jié)炎指數(shù),減少關節(jié)腫脹數(shù)和減輕關節(jié)腫脹度。隨劑量增加CK的抗炎作用逐漸增強,當劑量增加到160 mg/kg,其抗炎作用與80 mg/kg相比無統(tǒng)計學差異,已基本達到最大效能。CK的對數(shù)劑量與其全身評分的抑制率有明顯的線性關系(y=0.1606χ+0.1771,R2=0.8297,P=0.0116),CK的ED50值為102.5mg/kg。在抗炎作用起效

11、時間方面,CK(80mg/kg、160 mg/kg)d21開始起效,CK(40 mg/kg)d24開始起效,CK(10 mg/kg、20 mg/kg)d30開始起效,隨著劑量的增大,起效時間逐漸提前。
　　CK(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以降低脾臟指數(shù),減輕AA大鼠的脾臟病理改變,包括降低動脈周圍淋巴鞘和邊緣區(qū)厚度、減輕淋巴小結增生和生發(fā)中心形成。CK(40 mg/kg、80 mg

12、/kg、160 mg/kg)可以改善AA大鼠的關節(jié)病理,包括抑制滑膜細胞增生和血管翳形成,減輕滑膜組織炎細胞浸潤以及骨破壞。CK(40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以抑制滑膜細胞異常增殖,CK(1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)體外給藥顯著恢復FLS分泌OPG,抑制RANKL的分泌。
　　2.CK可以減少T、B細胞活化,恢復細胞因子平衡。
　　CK(40 mg/kg、80 mg/k

13、g、160 mg/kg)可以降低AA大鼠脾臟中活化的T細胞的比例和記憶B細胞的比例,提高Treg和初始T細胞的比例,抑制T、B細胞的增殖。CK(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以降低血清抗II型膠原抗體,CK可以降低(160 mg/kg)IgG2a水平;對抗CCP抗體IgG1的水平?jīng)]有影響。CK(40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)降低血清IL-1β水平,

14、對血清IL-4水平?jīng)]有影響。CK(20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以抑制巨噬細胞IFN-γ的分泌,CK(40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg)可以抑制巨噬細胞IL-17的分泌,CK(80 mg/kg、160 mg/kg)可以抑制TNF-α的分泌,促進IL-10的分泌。體外研究發(fā)現(xiàn)CK(10-5M,10-6M,10-7M)可以抑制AA大鼠T細胞的活化,表現(xiàn)為抑制其表面CD25的

15、表達以及IL-2的分泌。
　　3.CK可抑制樹突細胞成熟遷移和歸巢,減少T細胞的活化。
　　CK(56mg/kg、224mg/kg)可以減少CIA小鼠淋巴結mo-DC、pDC亞群的比例,增加初始T細胞比例,降低淋巴結CCL21水平。體外實驗發(fā)現(xiàn)CK(10-7M,10-5M)可以抑制DC上CCR7的表達,抑制CCL21介導的DC的遷移;抑制DC的成熟,降低其表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ的表達,減弱DC活化T細胞的