1、在對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的研究中，新西蘭大白兔是一種合適的動(dòng)物模型，由于兔脂聯(lián)素的序列尚未見(jiàn)報(bào)道，限制了利用該模型對(duì)脂聯(lián)素的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用進(jìn)行深入研究。這些問(wèn)題構(gòu)成了本研究的設(shè)計(jì)思路和研究目的。研究目的1．克隆新西蘭大白兔脂聯(lián)素cDNA并完成測(cè)序。 2．體外表達(dá)新西蘭大白兔脂聯(lián)素蛋白質(zhì)，明確克隆的基因含完整的開(kāi)放性閱讀框架(ORF)。 3．探討不同年齡組的新西蘭大白兔脂聯(lián)素基因表達(dá)的變化，明確年齡與脂聯(lián)素表達(dá)的關(guān)系。

2、 4．探討高膽固醇飼料喂養(yǎng)后新西蘭大白兔脂聯(lián)素基因表達(dá)的變化，明確高脂血1.新西蘭大白兔脂聯(lián)素cDNA序列的測(cè)定(1)取普通飼料喂養(yǎng)的3月齡正常雄性新西蘭大白兔頸背部皮下脂肪組織約100mg用于RNA的提取。 (2)脂肪組織RNA提取：使用Trizol試劑從組織中提取總RNA。 (3)兔脂聯(lián)素基因片段的克?。喊凑誐-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書(shū)配逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。根據(jù)人和小鼠脂聯(lián)素高度保守序列設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物。上游引物：5

3、'-ACACCTCCAGGGCTCAGGATGCT-3'，下游引物：5'-TCAGTTGGTATCATGGTAGAGAAG-3'。PCR反應(yīng)后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，割膠回收。并將其克隆入pGEM-T載體內(nèi)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。終產(chǎn)物命名為pGEM-T-APN。 (4)pGEM-T=APN連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽(yáng)性重組體。 (5)陽(yáng)性重組體的菌落37℃搖床擴(kuò)增，送上海英駿公司測(cè)序。 2.新西蘭

4、大白兔脂聯(lián)素蛋白質(zhì)的體外表達(dá)新西蘭大白兔脂聯(lián)素蛋白質(zhì)的體外表達(dá)與純化采用pGAPZ<,α> Pichia ExpressionKit(hwitrogen)試劑盒。 (1)以脂肪組織總cDNA為模板，用含EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物重新克隆脂聯(lián)素DNA，并將產(chǎn)物插入pGEM-T載體，產(chǎn)物命名為pGEM/APN，經(jīng)測(cè)序證實(shí)聯(lián)結(jié)正確。 (2)產(chǎn)物pGEM/APN與pGAPZ<,α> Pichia酵母雙酶切(.EcoRI

5、和Not Ⅰ)，將脂聯(lián)素DNA插入pGAPZ<,α>Pichia酵母表達(dá)載體中，得到產(chǎn)物pGAPZ<,α>-APN。 (3)將pGAPZ<,α>-APN轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在低鹽LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)入GS115酵母菌株，培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性單克隆。 (4)陽(yáng)性單克隆在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，脂聯(lián)素蛋白質(zhì)分泌入上清液中。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，Western blot分析蛋白質(zhì)分子量大小。

6、 (5)酵母培養(yǎng)液中脂聯(lián)素濃度分析利用大鼠抗人脂聯(lián)素ELISA試劑盒分析酵母上清液中脂聯(lián)素濃度。 3.年齡因素對(duì)新西蘭大白兔脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達(dá)的影響選取2周齡、1月齡、3月齡、6月齡、12月齡雄性新西蘭大白兔各10只，3﹪ 戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈麻醉后，各取頸背部皮下脂肪組織約100mg用于RNA的提取。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)脂肪組織mRNA的表達(dá)，ELISA試劑盒分析血清中脂聯(lián)素濃度。 4．高膽固醇飼料

7、喂養(yǎng)后新西蘭大白兔脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達(dá)的變化為研究高膽固醇飼料喂養(yǎng)后新西蘭大白兔脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，3月齡雄性新西蘭大白兔12只，體重1.5～2 kg，1﹪高膽固醇飼料喂養(yǎng)，由山東省農(nóng)科院購(gòu)買(mǎi)。分別于高膽固醇飼料喂養(yǎng)前及喂養(yǎng)后第1、2、3、4月時(shí)間點(diǎn)取脂肪組織和靜脈血標(biāo)本。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)脂肪組織mRNA的表達(dá)，ELISA試劑盒分析血清中脂聯(lián)素濃度。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。組間比較采

8、用方差分析，所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件包處理，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。 結(jié)果 1．新西蘭大白兔脂聯(lián)素cDNA序列測(cè)定經(jīng)RT-PCR方法克隆出兔脂聯(lián)素cDNA，測(cè)序證實(shí)含完整的開(kāi)放性閱讀框架(ORF)，即包含起始密碼子(atg)和終止密碼子(tga)。核苷酸序列分析顯示兔脂聯(lián)素cDNA序列與人、小鼠同源性分別為86.39﹪和81.45﹪，氨基酸序列的同源性分別為85.66﹪和85.25﹪。 2．新

9、西蘭大白兔脂聯(lián)素蛋白質(zhì)的體外表達(dá)Western blot分析證實(shí)，GS115酵母上清液中含脂聯(lián)素蛋白質(zhì)，分子量約30 kDa。ELISA分析，上清液中蛋白質(zhì)濃度為0.29±0.02μg/ml。 3．年齡因素對(duì)新西蘭大白兔脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達(dá)的影響熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，不同年齡組的新西蘭大白兔皮下脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)有顯著性差異(P<0.01)，在1月齡組最高，然后隨年齡增加而呈現(xiàn)出與年齡相關(guān)的下降趨勢(shì)。 血清

10、脂聯(lián)素濃度ELISA分析結(jié)果顯示，不同年齡組的新西蘭大白兔血清脂聯(lián)素濃度有顯著性差異(P<0.01)，在1月齡組最高，然后隨年齡增加而呈現(xiàn)出與年齡相關(guān)的下降趨勢(shì)。 4．高膽固醇飼料喂養(yǎng)后新西蘭大白兔脂聯(lián)素蛋白質(zhì)表達(dá)的變化高膽固醇飼料喂養(yǎng)后，脂肪組織脂聯(lián)素基因mRNA轉(zhuǎn)錄與血清HDL-C濃度成正相關(guān)(Pearson Correlation=0.469，P=0.001)，在對(duì)照組無(wú)此相關(guān)性。在高脂組和對(duì)照組，不同的時(shí)間點(diǎn)脂肪組織脂聯(lián)

11、素基因mRNA轉(zhuǎn)錄均不同(Repeated MeasurementsAnalysis of Variance，P<0.01)；在高膽固醇飼料喂養(yǎng)前，2組之間脂聯(lián)素基因mRNA轉(zhuǎn)錄無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在高膽固醇飼料喂養(yǎng)后1、2、3、4月固定的時(shí)間點(diǎn)上，2組之間脂聯(lián)素基因mRNA轉(zhuǎn)錄有顯著性差異(P<0.01)。高膽固醇飼料喂養(yǎng)對(duì)脂聯(lián)素血清濃度有相似的影響：脂聯(lián)素血清濃度與血清HDL-C濃度成正相關(guān)，在對(duì)照組無(wú)此相關(guān)性。在高脂組和

12、對(duì)照組，不同的時(shí)間點(diǎn)脂聯(lián)素血清濃度均不同：在高膽固醇飼料喂養(yǎng)前，2組之間脂聯(lián)素血清濃度無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在高膽固醇飼料喂養(yǎng)后1、2、3、4月固定的時(shí)間點(diǎn)，2組之間脂聯(lián)素血清濃度有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論 1．兔脂聯(lián)素cDNA序列、氨基酸序列與人、小鼠均有高度的同源性，脂聯(lián)素基因在兔、人、小鼠具有相似的功能。 2．在不同的年齡組脂聯(lián)素基因表達(dá)存在顯著性差異，在1月齡組最高，隨年齡增加而呈現(xiàn)出與

13、年齡相關(guān)的下降趨勢(shì)。 3．脂質(zhì)代謝異常對(duì)脂聯(lián)素的基因表達(dá)有顯著性影響，脂聯(lián)素與血清高密度脂蛋白膽固醇成正相關(guān)。 通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子KB(nuclear factor KB，NF-KB)，脂聯(lián)素抑制TNF α誘導(dǎo)的粘附分子的表達(dá)，抑制絲裂原活化蛋白(mitogen activated protein，MAP)通路進(jìn)而抑制生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞的增殖。在巨噬細(xì)胞，脂聯(lián)素抑制清道夫受體的表達(dá)和泡沫細(xì)胞的形成。因此，

14、脂聯(lián)素積聚在內(nèi)皮細(xì)胞損傷的部位，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)性效應(yīng)。 目前國(guó)內(nèi)、國(guó)際對(duì)脂聯(lián)素與胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系及作用機(jī)制方面做了大量的研究，但有許多問(wèn)題尚未明了： 1．在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到了脂聯(lián)素減輕動(dòng)脈內(nèi)膜的增厚，降低動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。脂聯(lián)素是通過(guò)什么途徑實(shí)現(xiàn)這種作用的? 2．血管周存在脂肪組織，局部脂肪組織分泌的脂聯(lián)素能否通過(guò)血管外膜影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生與發(fā)展? 3．在動(dòng)脈粥樣

15、硬化血管壁，通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶脂聯(lián)素基因的腺病毒，在體觀察斑塊的形態(tài)學(xué)改變?nèi)绾?，目前尚未?jiàn)相關(guān)報(bào)道。 以上這些問(wèn)題，構(gòu)成了本研究的設(shè)計(jì)思路和研究目的。 研究目的 1．對(duì)比脂聯(lián)素通過(guò)內(nèi)膜與外膜對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用。 2．觀察脂聯(lián)素對(duì)斑塊易損性的影響。 結(jié)論 1．動(dòng)脈粥樣硬化病變血管內(nèi)膜或外膜局部轉(zhuǎn)染Ad-APN后，斑塊的面積縮小，同時(shí)，血清脂聯(lián)素濃度明顯升高，脂聯(lián)素可通過(guò)抑制血管壁黏附分子VC