1、第一部分：為了探討褪黑素(MEL)在血管新生方面的作用和可能的抗腫瘤血管新生機制，以體外培養(yǎng)的臍靜脈內皮細胞(HUVECs)為模型，觀察MEL對HUVECs增殖和凋亡的影響。第二部分：在第一部分基礎上，探討高濃度MEL抑制HUVECs增殖和促其凋亡的可能細胞信號傳導通路。 方法：1.原代培養(yǎng)HUVECs，免疫磁珠篩選后，并用免疫組化和電鏡鑒定內皮細胞；MTT法測定不同濃度的MEL對HUVECs增殖的影響，并用流式細胞儀測定HUV

2、ECs細胞周期和細胞凋亡情況；免疫熒光、Westem Blot和RT-PCR檢測：MEL對HUVECs內凋亡相關蛋白P53、Bcl-2和Bax及其基因表達情況。2.在第一部分基礎上，KT-PCR檢測HUVECs褪黑素膜受體和核受體(MELR和RZR/ROR)的表達情況，以及MEL對其表達影響；檢測高濃度MEL對影響HUVECs增殖和凋亡的重要的細胞內信號通路RTK/ERK/P13K/AKT/PKC/NF-kB蛋白表達影響；應用MELR受

3、體阻滯劑Luzindole、ERK1/2激活抑制劑U0126、P13K/AKT抑制劑LY294002以及PKC激活劑PMA和抑制劑GF 109203X，觀察其對高濃度MEL抑制HUVECs增殖和相關細胞信號傳遞通路的影響。 結果：1.(1)成功的分離培養(yǎng)原代HUVECs，免疫磁珠篩選后能繼續(xù)貼壁生長并傳代，倒置顯微鏡下HUVECs呈鵝卵石狀，Ⅷ因子內皮細胞細胞免疫化學著棕色，電鏡下可見內皮細胞特征性的Weibel-Palade小

4、體。(2)極低濃度MEL(1nmol/L)對HUVECs增殖無明顯影響，但高濃度MEL(10nmol/L-1mmol/L)明顯抑制HUVECs增殖，并有濃度依賴傾向，1mmol/L抑制作用最明顯。(3)流式細胞儀顯示高濃度MEL 能明顯阻滯HUVECs細胞周期，能阻止細胞進入S期，引起“S期停滯”；凋亡分析顯示高濃度的MEL，能明顯促使HUVECs凋亡，lmmol/L時最明顯。(4)高濃度MEL(100nmol/L和lmmol/L)明顯

5、調節(jié)凋亡相關基因P53、Bax和Bcl-2的表達。(5)Westem Blot和免疫熒光檢測高濃度MEL促進HUVECs凋亡與細胞內P53和Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白下調有關。2.(1)正常HUVECs中褪黑素膜受體MELlaR和MELlbR都有明顯表達，而核受體家族中有RORa和RORb表達，以RORb表達更為突出，RORC幾乎無表達。(2)MEL受體參與MEL抑制HUVECs增殖機制，膜受體阻滯劑Luzindole只能部分阻

6、斷高濃度MEL的增殖抑制效應。(3)外源性MEL可使HUVECs上MEL受體表達下調，此過程可能與PKCot表達上調有關。(4)ERK1/2、P13K/AKT和PKC信號通路與HUVECs增殖密切相關，其特異的通路抑制劑能明顯抑制HUVECs增殖。(5)高濃度MEL通過抑制ERKl/2、P13K/AKT和PKC信號通路抑制了HUVECs增殖和促其凋亡，相應的通路抑制劑或激活劑能分別部分促進或阻斷MEL抑制HUVECs增殖效應。(6)ME

7、L抑制HUVECs中NF-kB的表達并抑制其和DNA結合，從而抑制HUVECs增殖和促其凋亡。(7)特異的ERKl/2、P13K/AKT和PKC信號通路抑制劑能不同程度的阻斷HUVECs中NF-kB的活性，和MEL作用類似，說明MEL可通過抑制ERK1/2、P13K/AKT和PKC信號通路抑制NF-kB的活性，從而影響細胞增殖和凋亡。 結論：高濃度的MEL能明顯抑制HUVECs增殖和促其凋亡；高濃度的MEL抑制HUVECs的增殖