1、目的:
　　 第二部分:為了探討褪黑素(MEL)對(duì)血管單層內(nèi)皮細(xì)胞屏障的保護(hù)作用,以培養(yǎng)在Transwell系統(tǒng)內(nèi)的單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為模型,觀察MEL對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。
　　 第三部分:觀察MEL對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的HUVECs間黏附連接和細(xì)胞骨架的影響。
　　 第三部分:探討MEL對(duì)單層內(nèi)皮細(xì)胞屏障保護(hù)作用可能的受體途徑和信號(hào)通路。
　　 方法:
　　

2、 第二部分:原代分離培養(yǎng)HUVECs,并使用包被小鼠抗人CD31單克隆抗體的免疫磁珠對(duì)原代分離的HUVECs進(jìn)一步純化。以小鼠抗人vWF單克隆抗體及FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗鑒定純化后的HUVECs。將純化后的HUVECs接種在Transwell系統(tǒng),通過(guò)檢測(cè)不同干預(yù)條件下透過(guò)單層內(nèi)皮的熒光標(biāo)記的葡聚糖來(lái)反映內(nèi)皮通透性的改變。
　　 第三部分:用免疫熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察不同干預(yù)條件下內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接蛋白VE鈣粘

3、素(VE-cadhedn)和細(xì)胞骨架蛋白的變化情況。使用Westernblot檢測(cè)VE-cadherin的表達(dá)變化情況。
　　 第三部分:檢測(cè)MEL和IL-1β對(duì)影響內(nèi)皮細(xì)胞間連接和細(xì)胞骨架的重要的信號(hào)通路Rho GTPase家族中Rac蛋白的影響；應(yīng)用MEL受體阻滯劑Luz、Rac的抑制劑NSC-23766,探討MEL發(fā)揮HUVECs屏障保護(hù)作用的受體途徑和信號(hào)通路。
　　 結(jié)果:
　　 第二部分:(1)成功分

4、離培養(yǎng)原代HUECs,免疫磁珠篩選后能繼續(xù)貼壁生長(zhǎng)并傳代,倒置顯微鏡下HUVECs呈鵝卵石狀,vWF免疫熒光染色證實(shí)細(xì)胞確為HUVECs。細(xì)胞呈梭形、圓形或多角形。(2)與空白對(duì)照組相比,5、10和20ng/mL的IL-1β分別使HUVECs通透性由1.5±0.1升高為4.8±0.3、5.2±0.4和9.8±0.8(P<0.01)；10和100μ mol/L的MEL分別使10ng/mL的IL-1β誘導(dǎo)的通透性從5.2±0.4降至2.8±

5、0.3和2.7±0.3(P<0.01).此結(jié)果與“時(shí)間-過(guò)程”通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　 第二部分:(1)熒光顯微鏡觀察:正常融合后的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VE-cadherin呈現(xiàn)出連續(xù)不間斷的狀態(tài)；IL-1β(10ng/ml)破壞了細(xì)胞間的黏附連接,使VE-cadherin在細(xì)胞膜上的表達(dá)下調(diào),并出現(xiàn)斷裂。MEL(10μmol/L)預(yù)處理后,VE—cadherin的表達(dá)狀態(tài)得到了改善。(2)激光共聚焦顯微鏡下觀察:IL-1β(10ng

6、/ml)明顯的破壞了細(xì)胞間的黏附連接,使正常狀態(tài)下分布在細(xì)胞邊緣的肌動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭缂?xì)胞體的應(yīng)力纖維,原本融合的細(xì)胞間出現(xiàn)明顯的縫隙。MEL(10μmol/L)預(yù)處理后,沒(méi)有出現(xiàn)明顯的黏附連破壞現(xiàn)象,細(xì)胞中心應(yīng)力纖維的表達(dá)減少,邊緣部位的肌動(dòng)蛋白增加,細(xì)胞間縫隙變小。(3)Western Blot結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,IL-1β使HUVECs的VE-cadherin表達(dá)量下調(diào)。MEL可抑制IL-1β誘導(dǎo)的VE-cadherin下調(diào),但仍

7、低于對(duì)照組。
　　 第三部分:(1)Luz阻斷了MEL對(duì)內(nèi)皮屏障的保護(hù)作用；阻斷了MEL對(duì)內(nèi)皮黏附連接和細(xì)胞骨架的影響,導(dǎo)致細(xì)胞連接破壞和應(yīng)力纖維增加,細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙。(2)MEL預(yù)處理抑制了IL-1β誘導(dǎo)的Rac的失活,而Luz可以阻斷MEL的這種作用。(3)NSC-23766抑制了MEL對(duì)內(nèi)皮屏障的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論:(1)IL-1β誘導(dǎo)HUVECs黏附連接蛋白VE-cadherin表達(dá)降低,應(yīng)力纖維增加,細(xì)胞間