1、[目的](1)探討Pin1蛋白的表達(dá)與骨肉瘤組織生物學(xué)行為之間的關(guān)系；(2)克隆正、反義人PIN1基因(hPIN1)及構(gòu)建hPIN1基因正、反義真核表達(dá)載體；(3)觀察以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為載體的PIN1反義基因轉(zhuǎn)染對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。 [方法](1)用免疫組織化學(xué)ABC法對(duì)42例骨肉瘤組織中Pinl蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；(2)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63細(xì)胞總RNA中成功擴(kuò)增出0.990kbp

2、包含hPIN1基因編碼區(qū)的cDNA序列，按正、反方向加上BamHⅠ及HindⅢ雙酶切位點(diǎn)后形成正、反義hPIN1基因，然后連入含BamHⅠ及HindⅢ雙酶切位點(diǎn)的pIRES2-EGFP表達(dá)質(zhì)粒上，構(gòu)建正、反義hPIN1基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒phPIN1。經(jīng)BamHⅠ及HindⅢ雙酶切后證實(shí)正、反義表達(dá)載體構(gòu)建成功；(3)用不同量(0、20、50、100、200、250μl)的以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為載體包裝的反義PIN1基因轉(zhuǎn)染人

3、骨肉瘤細(xì)胞系MG-63細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染前后的培養(yǎng)細(xì)胞和上清液，用MTT法觀測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；用流式細(xì)胞儀觀測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期變化和細(xì)胞凋亡情況；用免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)Pin1蛋白的表達(dá)變化；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PIN1mRNA的表達(dá)變化。 [結(jié)果](1)42例骨肉瘤組織中Pin1蛋白的表達(dá)率為63.5％，在對(duì)照組的10例正常外傷性截肢者的骨軟骨組織中未見其表達(dá)；Pin1蛋白的表達(dá)與骨肉

4、瘤的臨床分期有關(guān)，但與患者的性別、年齡、腫瘤部位、Price組織學(xué)分級(jí)及是否有軟組織侵犯無關(guān)；(2)擴(kuò)增的cDNA經(jīng)測(cè)經(jīng)序與基因文庫(kù)完全一致；BamHⅠ及HindⅢ雙酶切后，正、反義表達(dá)質(zhì)粒形成5.3+0.990kbp兩條帶，與理論計(jì)算值完全一致；(3)MTT法和流式細(xì)胞儀顯示反義PIN1基因轉(zhuǎn)染能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡；Western-Blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染反義PIN1基因的量越多，其灰度越低，測(cè)得空白對(duì)照組及不同量(0、20、50、

5、100、200、250μl)的轉(zhuǎn)染基因組其相應(yīng)的吸光度比值分別為0.854±0.136、0.866±0.138、0.732±0.154、0.611±0.121、0.547±0.109、0.398±0.113、0.320±0.151，差異有顯著性(P＜0.05)；RT-PCR檢測(cè)其灰度比值分別為0.983±0.125、0.988±0.127、0.915±0.157、0.786±0.125、0.608±0.124、0.433±0.130、0