1、骨骼中有豐富的感覺神經(jīng)支配，這些神經(jīng)除了傳遞痛覺之外，還能夠分泌神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽等調(diào)控骨形成，為了研究外源性P物質(zhì)對牽張成骨中骨形成的影響及其機理，我們設(shè)計了以下實驗：
　　實驗一：外源性P物質(zhì)對大鼠下頜骨牽張成骨的影響
　　目的：P物質(zhì)是感覺神經(jīng)纖維分泌的神經(jīng)肽，其具有調(diào)控骨形成的功能，但其對牽張成骨的影響，尚未有報道。本實驗通過局部注射10-7M的P物質(zhì)來研究P物質(zhì)對牽張大鼠下頜骨牽張成骨的影響。

2、　　方法：20只大鼠行右側(cè)下頜骨牽張成骨后經(jīng)過5天的延遲期，在牽張期10天中，每12小時牽張0.2mm，實驗組在牽張期內(nèi)每日向牽張區(qū)注射0.2ml10-7M的P物質(zhì)溶液（對照組注射相同劑量的生理鹽水）；動物分別在固定期第0、14天處死取材行Micro-CT檢測、HE染色。
　　結(jié)果：在術(shù)后15日，Micro-CT檢測骨密度結(jié)果顯示實驗組高于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義p<0.05；術(shù)后29日，實驗組的骨密度和骨體積分?jǐn)?shù)均高于對照組。HE

3、染色發(fā)現(xiàn)：實驗組的骨小梁結(jié)構(gòu)較對照組成熟，骨小梁面積高于對照組。
　　結(jié)論：局部注射10-7M的P物質(zhì)能夠促進大鼠下頜骨牽張成骨新骨形成及成熟程度。
　　實驗二外源性P物質(zhì)在牽張成骨中對間充質(zhì)干細胞動員的實驗研究
　　目的：實驗一結(jié)果顯示局部注射10-7M的P物質(zhì)可以促進大鼠牽張成骨中新骨形成，但其機制并不清楚，本實驗通過檢測牽張局部的間充質(zhì)干細胞遷移和外周血中的CD29+細胞數(shù)目來研究外源性 P物質(zhì)在大鼠牽張成骨中對

4、間充質(zhì)干細胞的動員影響。
　　方法：20只大鼠行右側(cè)下頜骨牽張成骨后經(jīng)過5天的延遲期，在牽張期10天中，每12小時牽張0.2mm，實驗組在牽張期10天內(nèi)每日向牽張區(qū)注射10-7M的P物質(zhì)溶液0.2ml（對照組注射相同劑量的生理鹽水）；動物分別在固定期第0、14天處死取材行Nestin免疫組織化學(xué)染色，并在手術(shù)后第術(shù)后5、6、11、15、22、29d經(jīng)鼠尾靜脈采血0.1ml經(jīng)流式細胞儀檢測外周血中的CD29+細胞數(shù)目。
　　結(jié)

5、果：Nestin免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，實驗組 Nestin陽性細胞分布于牽張間隙中，而對照組主要位于微血管周圍；流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)在術(shù)后第11、15、22天SP組外周血中的CD29+細胞明顯高于對照組（p<0.05），術(shù)后第29天實驗組低于對照組（p<0.05）。
　　結(jié)論：局部注射10-7M的P物質(zhì)可以更有效的動員間充質(zhì)干細胞向牽張區(qū)域遷移。
　　實驗三局部應(yīng)用P物質(zhì)對大鼠下頜骨牽張成骨中SDF-1表達的影響
　　目

6、的：以上結(jié)果顯示局部注射10-7M的P物質(zhì)可以促進間充質(zhì)干細胞動員影響大鼠牽張成骨中新骨形成，而SDF-1的濃度對干細胞遷移起到重要作用。
　　方法：30只大鼠行右側(cè)下頜骨牽張成骨后經(jīng)過5天的延遲期，在牽張期10天中，每12小時牽張0.2mm，實驗組每日向牽張區(qū)注射0.2ml10-7M的P物質(zhì)，對照組注射相同劑量的生理鹽水，動物分別在術(shù)后第15天取材行SDF-1免疫組化染色，在術(shù)后第6、15、29天取材行實時定量PCR并在手術(shù)后第

7、6、11、15、29d經(jīng)鼠尾靜脈采血0.5ml后ELISA試劑盒檢測血漿中SDF-1濃度。
　　結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記SDF-1后觀察到SP組SDF-1表達高于對照組；實時定量PCR和ELISA均顯示在術(shù)后第15天檢測到實驗組牽張區(qū)和外周中的SDF-1及其mRNA表達均處于峰值并明顯高于對照組（p<0.05）。
　　結(jié)論：局部注射10-7M的P物質(zhì)可以提高牽張區(qū)和外周血中SDF-1的表達。
　　實驗四外源性P物質(zhì)對

8、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外遷移的影響
　　目的：上述實驗說明，局部注射外源性的 P物質(zhì)可以增強局部和全身間充質(zhì)你干細胞的動員，干細胞動員后遷移到創(chuàng)傷區(qū)域也是干細胞參與牽張區(qū)新骨形成的重要一步，本實驗研究外源性 P物質(zhì)對大鼠間充質(zhì)干細胞體外遷移的影響。
　　方法：10只大鼠（80±20g，4周齡）處死后取雙側(cè)下頜骨剪碎后膠原酶消化法取原代細胞進行培養(yǎng)，擴充至第三代后流式細胞術(shù)測定表面抗型進行鑒定，實驗組培養(yǎng)液中含有10-7 M

9、P物質(zhì)，在接種后第1、3、5、7天取培養(yǎng)基行ELISA SDF-1濃度測定，并獲取細胞行實時定量PCR檢測SDF-1mRNA表達，培養(yǎng)7日后鑒定表面CXCR4的表達，并行tranwell遷移實驗比較細胞體外遷移能力。
　　結(jié)果：從下頜骨中分離的原代培養(yǎng)細胞呈梭型貼壁生長，對第三代細胞表型經(jīng)流式細胞儀鑒定后發(fā)現(xiàn)CD90、CD29、CD44陽性，CD34、CD45陰性，加入10-7M SP組，SDF-1及其mRNA表達均高于對照組（p

10、<0.05），培養(yǎng)7天后BMSCs表面CXCR-4表達倍增（p<0.05）,transwell遷移實驗組，實驗組穿膜細胞數(shù)量遠遠高于對照組（p<0.05）。
　　結(jié)論：外源性10-7M的P物質(zhì)在體外實驗中可以促進BMSCs分泌SDF-1，并增加BMSCs膜表面的CXCR4表達，同時可以增強BMSCs的體外遷移能力。
　　實驗五外源性P物質(zhì)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖活性和成骨能力的影響
　　目的：骨髓間充質(zhì)干細胞受到機體

11、動員后遷移到牽張間隙黏附于基質(zhì)網(wǎng)開始增殖和分化參與骨形成的過程，本實驗觀察加入外源性 P物質(zhì)后大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖活性和成骨能力的變化。
　　方法：實驗四培養(yǎng)的第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，實驗組培養(yǎng)液中含有10-7 M P物質(zhì)，培養(yǎng)3日后BrdU染色，14天后觀察集落形成，成骨分化中培養(yǎng)7天后加入含有P物質(zhì)的成骨誘導(dǎo)液，分別在1、7、14天檢測堿性磷酸酶活性、ALP、Runx2的mRNA表達，第14天茜素紅染色。
　　結(jié)果：