1、目的：1.本研究從兔骨髓液中分離骨髓間充質干細胞(BMSCs),進行體外培養(yǎng),旨在建立一套行之有效的體外分離,培養(yǎng)BMSCs的方法。2.通過各代觀察BMSCs的形態(tài),檢測不同代BMSCs的細胞增殖周期和細胞生長周期,從而了解各代BMSCs的生物學性狀以及初步確定作為理想的組織工程種子細胞的理想代數。3.BMSCs在成骨誘導液的誘導下向成骨細胞特定分化,通過檢測成骨細胞特有指標Ⅰ型膠原,堿性磷酸酶和鈣結節(jié)的表達,了解BMSCs向成骨細胞方

2、向分化的能力。
　　方法：1.利用骨穿針在兔股骨抽取骨髓液,利用密度梯度離心法聯合貼壁細胞篩選法對BMSCs進行體外培養(yǎng),觀察細胞的生長情況。2.觀察各代細胞形態(tài)并且測定各代細胞的增殖周期和細胞生長周期,了解各代細胞的生物學性狀。3.在體外利用成骨誘導液(完全培養(yǎng)基中加入地塞米松濃度為10-8mol/L、β-磷酸甘油鈉10mmol/L、維生素C50ug/ml),在誘導的第7天,第14天和第21天分別檢測Ⅰ型膠原,堿性磷酸酶(ALP

3、),鈣結節(jié)表達。研究BMSCs向成骨細胞分化的能力。
　　結果：1.利用密度梯度離心法聯合貼壁篩選法分離出了大量具有活性的BMSCs。接種48小時后觀察,見少量細胞呈長梭性,大部分為短梭形和多邊形。接種72小時觀察,貼壁細胞明顯增多,呈長梭形。接種第5天,細胞增殖明顯,并且可見若干細胞團落形成。接種第7天,達到融合。2.第1,5,10代細胞經MTT和流式細胞儀檢測,第1代和第5代的增殖能力和生長周期無顯著性差異(P>0.05),第

4、10代細胞與第1代細胞,第5代細胞之間的增殖能力和細胞生長周期較前兩代有明顯的差別(P<0.05)。3.BMSCs向成骨方向分化:貼壁細胞隨著時間的延長,由最初的長梭狀,逐漸向多角形發(fā)展。誘導組細胞呈現接觸性抑制,正常組呈現重疊性生長。Ⅰ型膠原染色顯示誘導組細胞胞質呈現棕黃色,正常組胞質未染色。ALP酶標法顯示誘導組較正常組的含量明顯增加(P<0.05)。誘導組鈣結節(jié)染色呈紅色,正常組未染色。顯示BMSCs在特定條件下可以很好的向成骨細

5、胞分化。
　　結論：1.通過利用密度梯度離心法聯合貼別篩選法可以獲得較高純度和活性的BMSCs。2.通過對各代BMSCs形態(tài)學的觀查,細胞增殖周期和細胞生長周期的檢測,證實第1,5代細胞之間的生物學特性無明顯的區(qū)別,第10代細胞增值減慢,處于非分裂期的細胞明顯增多,與第1,5代細胞之間有明顯的差別,且第5細胞已成為單一細胞系,所以確立第5代細胞可以成為組織工程中提供良好的種子細胞。3.通過利用成骨誘導液對BMSCs向成骨細胞誘導,