1、[目的和意義]
　　更年期綜合征是干擾中老年婦女生活質(zhì)量的重要影響因素。雖然現(xiàn)代分子學(xué)已發(fā)現(xiàn)更年期綜合征可能與內(nèi)分泌、免疫、自由基及細(xì)胞凋亡有關(guān)，但這些獨(dú)立的機(jī)制與病理表征之間的聯(lián)系仍不明確。
　　貫葉連翹被認(rèn)為是治療更年期綜合征長(zhǎng)效、安全的中草藥之一，臨床用于替代雌激素療法，以降低因長(zhǎng)期服用雌激素而罹患乳腺癌、冠心病、中風(fēng)和血栓的風(fēng)險(xiǎn)。在治療更年期抑郁、潮熱、肥胖、記憶衰退、風(fēng)濕類風(fēng)濕等疾病方面療效尤其顯著。然而貫葉連翹活

2、性成分十分復(fù)雜，且給藥劑量多樣，使其臨床治療有效性受到質(zhì)疑。目前大部分的臨床研究主要集中在貫葉連翹的抗抑郁作用上，但這些研究成果并不適于對(duì)更年期綜合征治療機(jī)制的解釋，說(shuō)明貫葉連翹的治療策略及對(duì)更年期綜合征的干預(yù)機(jī)制還有待于進(jìn)一步發(fā)掘。
　　為了了解更年期綜合征的代謝特征，探索貫葉連翹在治療過(guò)程中對(duì)已知或未知生物通路的作用。本研究利用一維核磁共振(1H-NMR)靶向代謝組學(xué)及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS/MS)的發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)研究方法

3、，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，尋找濃度或豐度改變顯著的模型差異表達(dá)代謝物，通過(guò)鑒定代謝物結(jié)構(gòu)，構(gòu)建更年期綜合征體內(nèi)代謝輪廓與疾病代謝表型關(guān)系的代謝網(wǎng)絡(luò)，從生化、病理和代謝三個(gè)水平深入研究貫葉連翹對(duì)更年期綜合征的代謝調(diào)控，期望從代謝物水平上揭示貫葉連翹對(duì)更年期綜合征的調(diào)控機(jī)制。
　　[研究方法]
　　1.以大鼠去卵巢模型模擬更年期婦女卵巢激素缺乏導(dǎo)致更年期綜合征的病理狀態(tài)。采用1H-NMR及HPLC-MS/MS技術(shù)，對(duì)OVX及正常樣本

4、進(jìn)行快速代謝物差異分析，靶向測(cè)定差異表達(dá)的代謝物，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，選定疾病診斷生物標(biāo)記物。
　　2.利用ChenomxNMR定量分析軟件對(duì)生物樣本中的小分子代謝物進(jìn)行定量，建立1H-NMR靶向代謝組學(xué)研究方法。
　　3.，采用HPLC-MS/MS技術(shù)，以多個(gè)pH值液液萃取系統(tǒng)提取尿樣代謝物，建立了非靶向的、基于質(zhì)譜的發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)研究方法，以增加1H-NMR測(cè)定結(jié)果的可靠性。
　　4.對(duì)不同劑量貫葉連翹給予OVX大

5、鼠后的代謝特征進(jìn)行分類比較，鑒定并定量分析貫葉連翹對(duì)更年期綜合征干預(yù)的差異表達(dá)代謝物。尋找給藥靶器官，構(gòu)建貫葉連翹治療機(jī)制的代謝網(wǎng)絡(luò)，選定治療生物標(biāo)記物，建立代謝組學(xué)藥物治療療效評(píng)價(jià)模型。
　　[結(jié)果與討論]
　　1.以偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和方差分析方法對(duì)1H-NMR和HPLC-MS/MS分別得到的代謝物進(jìn)行篩選，結(jié)果得到53個(gè)與更年期綜合征診斷相關(guān)的差異表達(dá)代謝物。將代謝物進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后發(fā)現(xiàn)，有6條代謝通

6、路與更年期綜合征顯著相關(guān)，包括糖酵解和糖異生、三羧酸循環(huán)、脂肪酸生物合成與氧化代謝、蛋氨酸循環(huán)、一碳單位途徑和尿素循環(huán)（精氨酸及脯氨酸代謝）途徑。
　　其中，檸檬酸、3-羥基丁酸和丙酮酸水平下降，棕櫚酸、肉毒堿和乙酰基肉毒堿水平上升可作為更年期體重異常的診斷標(biāo)記物;膽堿、甜菜堿和蛋氨酸水平上升，?；撬岷蚇，N-二甲基甘氨酸(DMG)水平下降可作為更年期抑郁癥的診斷標(biāo)記物;γ-氨基丁酸水平下降，谷氨酸、組氨酸、甲基組氨酸和精氨酸水平

7、上升可作為更年期記憶衰退的診斷標(biāo)記物;鳥氨酸、胞嘧啶、β-丙氨酸和精胺水平上升可作為更年期乳腺癌的診斷標(biāo)記物;血清尿囊素、谷氨酸水平上升，谷氨酰胺水平下降可作為更年期痛風(fēng)的診斷標(biāo)記物;5-羥色胺(5-HT)、色氨酸和甲酸水平下降，3-吲哚磺酸水平上升可作為更年期潮熱及慢性腎病的診斷標(biāo)記物。
　　2.對(duì)不同月齡大鼠尿樣代謝物水平比較結(jié)果顯示，有29個(gè)差異表達(dá)的代謝物與年齡增長(zhǎng)有關(guān)，與對(duì)照組相比大部分代謝物呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其中煙酰胺、N

8、-甲基煙酰胺、胍基丁胺、亞精胺和精胺被選定為指示自然更年期疾病的生物標(biāo)記物。這些代謝物水平的降低，可以用于預(yù)測(cè)肝臟線粒體功能隨著機(jī)體衰老而逐漸減少，NAD+呼吸鏈反應(yīng)效能降低，機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)加速產(chǎn)生，炎癥反應(yīng)增多，最終導(dǎo)致心血管疾病、糖尿病和認(rèn)知性疾病等慢性疾病的產(chǎn)生。
　　3.通過(guò)比較不同劑量貫葉連翹給藥前后OVX大鼠的代謝物水平結(jié)果顯示，貫葉連翹能夠逆轉(zhuǎn)多個(gè)更年期綜合征生物標(biāo)記物的紊亂變化，并呈現(xiàn)出與相關(guān)酶活性及受體飽和度的

9、相關(guān)的治療作用。經(jīng)篩查、鑒定和定量給藥前后血清和尿樣中的差異調(diào)節(jié)代謝物，有23個(gè)代謝物在解釋貫葉連翹治療機(jī)制方面具有重要意義。代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果顯示，與貫葉連翹治療機(jī)制相關(guān)的代謝物和中間體生化途徑涉及4條主要代謝通路，包括精氨酸和脯氨酸代謝途徑、丙酮酸代謝途徑、組氨酸代謝途徑和脂肪酸合成途徑。
　　結(jié)合代謝物水平變化與代謝通路分析顯示，貫葉連翹作用的主要靶器官是肝臟，其治療作用是從調(diào)節(jié)肝臟代謝中精氨酸、鳥氨酸、蛋氨酸、牛磺酸、肉毒堿

10、和三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物的水平恢復(fù)開始的。其次使膽堿、甜菜堿生成正常，改善了脾臟的退行性變化，增強(qiáng)了脾臟的抗炎作用，進(jìn)一步抑制了與炎癥效應(yīng)相關(guān)的更年期阿爾茨海默病、糖尿病和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的產(chǎn)生。另外，貫葉連翹還能通過(guò)顯著降低3-吲哚磺酸在腎臟的蓄積，降低腎小管上皮細(xì)胞中的NF-kappaB表達(dá)，產(chǎn)生解毒效應(yīng)，使慢性腎臟疾病癥狀得到緩解。3-吲哚磺酸水平下降使得色氨酸水平恢復(fù)正常，促進(jìn)色氨酸代謝生成5-HT，恢復(fù)5-HT對(duì)體溫中樞的調(diào)

11、節(jié)能力，產(chǎn)生緩解潮熱癥狀的作用。
　　[結(jié)論]
　　1.本研究運(yùn)用1H-NMR和HPLC-MS/MS技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)更年期雌激素衰亡誘發(fā)代謝紊亂的分子機(jī)制進(jìn)行表征，構(gòu)建了代謝物水平與疾病產(chǎn)生的代謝網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有53個(gè)代謝物的差異表達(dá)與更年期綜合征代謝紊亂相關(guān)，這些代謝物的水平變化可以作為更年期綜合征不同癥型的診斷標(biāo)記物。其中，3-吲哚磺酸是首次在更年期綜合征動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)的與更年期慢性腎病相關(guān)的重要生物標(biāo)記物。同時(shí)

12、，3-吲哚磺酸水平異常還和更年期潮熱癥狀有很大關(guān)系。
　　2.本階段研究首次將煙酰胺、N-甲基煙酰胺、胍基丁胺、亞精胺、精胺選定為指示細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降導(dǎo)致機(jī)體衰老的潛在生物標(biāo)記物，并有待于HPLC-MS/MS靶向代謝組學(xué)的進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　3.在貫葉連翹治療機(jī)制研究中，找到與治療相關(guān)的差異表達(dá)代謝物共29個(gè)。研究揭示了貫葉連翹對(duì)更年期綜合征治療作用的主要靶器官為肝臟和脾臟，其次為腎臟。其中，本研究首次發(fā)現(xiàn)貫葉連翹對(duì)GABA、

13、多巴胺和5-HT受體的調(diào)控作用與其對(duì)精氨酸、丙酮酸和色氨酸代謝途徑的調(diào)節(jié)有密切關(guān)系。尤其是給藥后尿樣中乙酸水平顯著升高，顯示出貫葉連翹對(duì)丙酮酸代謝途徑中乙酸→乙醛酸通路的干預(yù)結(jié)果。揭示了貫葉連翹一個(gè)重要治療機(jī)制是對(duì)丙酮酸代謝途徑中乙醛脫氫酶2(ALDH2)的調(diào)節(jié)作用。使ALDH2不僅通過(guò)降低氧化應(yīng)激減少機(jī)體炎癥和細(xì)胞凋亡的發(fā)生來(lái)降低更年期糖尿病、帕金森病的產(chǎn)生，還能抑制多巴胺降解生成神經(jīng)毒性化合物3，4-dihydroxyphenyla