1、腸桿菌科細菌是重要的醫(yī)院感染病原菌，因不規(guī)范的抗菌藥物使用，腸桿菌科細菌對抗菌藥物的耐藥狀況不斷惡化，致使它們對大多數(shù)臨床常用的藥物的耐藥率＞50％。碳青霉烯類抗生素是僅剩的幾種對大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌還保持高敏感性的藥物，近來出現(xiàn)了越來越多的對碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細菌，嚴重威脅著抗感染治療，引起了世界各國抗感染專家和臨床微生物工作者的極大關注。KPC型碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapen

2、emase，KPC）的產生是目前引起腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因?，F(xiàn)有文獻顯示攜帶blaKPC-2的轉座子廣泛存在于不同大小、不同結構的質粒中，其中大多數(shù)質粒可通過接合試驗成功轉移至受體菌，攜帶blaKPC-2的宿主細菌也多種多樣。中國KPC酶（blaKPC-2編碼）的流行涉及轉座子、質粒和宿主三個環(huán)節(jié)。我們認為blaKPC-2的流行可能并非簡單克隆播散，可能是由高活動能力的轉座子介導，由寬宿主、穩(wěn)定、轉移能力強的質粒，

3、通過接合播散至廣泛流行的不同種類的腸桿菌細菌。課題組收集自華山醫(yī)院blaKPC-2初現(xiàn)到爆發(fā)時間段內所有腸桿菌科分離株為研究對象，首先對轉座子、質粒和細菌進行恰當?shù)姆中?，然后研究每一流行環(huán)節(jié)的特點及其對基因水平轉移的作用，研究并正確評估每一個環(huán)節(jié)的作用特點，是掌握blaKPC-2在中國快速播散的機制，找到正確控制blaK PC-2致碳青霉烯類耐藥的基礎，為改進或建立新的控制耐藥菌播散模式提供可靠的理論基礎，對醫(yī)院感染的監(jiān)控與治療具有較大

4、的意義。
　　第一部分 碳青霉烯酶KPC酶和膜孔蛋白OmpK35與OmpK36誰是導致腸桿菌科細菌對碳青霉烯類耐藥的主要原因
　　目的:判定臨床分離的產2型碳氫酶烯酶的肺炎克雷伯菌分離株中，β內酰胺酶和OmpK35與OmpK36蛋白誰才是導致細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。方法:連續(xù)收集57株非重復的耐碳氫酶烯類的肺炎克雷伯菌分離株，首先采用等電聚焦電泳初步分析細菌產生β內酰胺酶的情況，再用PCR，基因測序進一步確認，

5、MLST法分析細菌的基因型別。然后選擇6株產生KPC酶的代表性分離株，采用qRT-PCR和蛋白電泳分析外膜蛋白的表達，PCR及PCR產物測序進一步分析外膜蛋白的表達及功能，將外膜蛋白缺陷的菌株與外膜蛋白完整的菌株組成配對組，采用λ-Red重組法敲除blaKPC-2基因，比較兩組細菌及其在敲除blaKPC-2基因前后對碳青霉烯類的MICs，以研究KPC酶及外膜蛋白OmpK35與OmpK36在肺炎克雷伯菌臨床分離株對碳青霉烯類耐藥中的作用。

6、
　　結果:57株分離株共有4種MLST基因型，其中50株ST11型，5株ST423型，1株ST65型，有一株屬于新的MLST型別，ST977型。全部的6株代表性分離株均產生β內酰胺酶KPC-2，TEM-1和CTX-M-14，分離株XJ-3和XJ-5還分別攜帶blaDHA-1和blaVM-1。在分離株XJ-1中，qRT-PCR和蛋白電泳均顯示OmpK35和OmpK36蛋白表達明顯下降，J-3和XJ-6分離株的ompK36基因突變導

7、致功能缺陷性，分離株XJ-2、XJ-4和J-5的OmpK35和Ompk36的表達和功能正常。藥敏結果顯示，外膜蛋白低表達或缺陷的菌株X J-1、XJ-3和J-6對碳青霉烯類的MICs高(＞32 mg/L)，而外膜蛋白表達和功能正常的菌株X J-2、XJ-4和XJ-6對碳青霉烯類的MICs相對較低(2-4 mg/L)，結果顯示外膜蛋白OmpK35和Ompk36在野生菌株對碳青霉烯類的耐用中有重要作用。敲除blaK PC-2基因后，分離株X

8、J-1和XJ-4對亞胺培南，美羅培南和厄他培南的MICs值都產生了8倍的下降，產生AmpC酶或其他種類碳青霉烯酶的分離株XJ-3和XJ-5，對碳青霉烯類的MICs則仍大幅降低。結果顯示敲除blaKPC-2基因的試驗菌株對碳青霉烯類的耐藥似乎與外膜蛋白OmpK35和Ompk36是否正常無關。
　　結論:綜合上述實驗結果，我們認為臨床肺炎克雷伯菌株對碳青霉烯的耐藥中，是否產生碳青霉烯酶或其他β-內酰胺酶是主導因素，外膜蛋白OmpK35

9、和OmpK36缺陷是輔助因素。
　　第二部分 轉座子和質粒對碳青霉烯酶基因blaKPC-2在腸桿菌科細菌中水平播散的作用研究
　　目的:通過研究華山醫(yī)院blaKPC-2初現(xiàn)到爆發(fā)時間段內108株產2型碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌分離株完整的blaKPC-2基因周圍DNA序列及重要質粒的全序列，了解blaKPC-2基因在腸桿菌科細菌細胞內及菌細菌間的運動模式。
　　方法:收集華山醫(yī)院blaKPC-2初現(xiàn)到爆發(fā)時間段內108株

10、攜帶KPC-2型碳青霉烯酶腸桿菌科細菌分離株。采用K-B紙片擴散法檢測受試菌株對21種抗菌藥物的敏感性，采用PCR擴增和測序檢測碳青霉烯酶基因，PCR mapping測定耐藥基因周圍環(huán)境和轉座子結構，利用MLST分型技術對菌株間的同源性進行分析，通過接合實驗、質粒提取、Southem雜交等方法確定耐藥基因的定位的質粒，鳥槍法測序測定攜帶耐藥基因的質粒序列，并通過生物信息學方法分析基因結構。
　　結果:所有菌株均攜帶blaKPC-2

11、基因， blaKPC-2基因位于結構不同的Tn1721-Tn3樣轉座子上，包括完整的Tn1721、Tn1721-Tn3樣轉座子及Tn1721-IS26復合轉座子，本批研究菌株中，出現(xiàn)最多的Tn1721-IS26復合轉座子(72/108)。攜帶blaKPC-2基因的轉座子可在不同類型的質粒間移動，接合性質粒則是運載blaKPC-2基因在不同MLST型別的腸桿菌科細菌及不同種類細菌間播散的工具。質粒分型最初分離到的攜帶blaK PC-2的質

12、粒以及隨后兩年散發(fā)發(fā)現(xiàn)的blaKPC-2陽性質粒均為P31型，而導致blaKPC-2爆發(fā)的質粒為F12型。
　　結論:攜帶blaKPC-2基因耐藥菌株已經(jīng)在國內醫(yī)院廣泛流行，該基因最常位于Tn1721-IS26復合轉座子上，可通過不同型別的可接合質粒接合轉移，很好地揭示了國內blaKPC-2基因的水平播散傳播途徑。
　　第三部分 轉座子Tn1721同時含有質粒介導磷霉素耐藥基因fosA3和碳氫酶烯酶基因blaKPC-2

13、>　　為理解腸桿菌科分離株對碳氫酶烯酶耐藥和磷霉素耐藥的遺傳學背景和播散機制，研究了一株臨床大腸桿菌分離株HS102707，一株臨床產氣腸桿菌分離株HS112625，兩株分離株均對磷霉素耐藥，亞胺培南中敏，blaKPC-2和fosA3基因均陽性，此外，一株碳氫酶烯耐藥但磷霉素敏感的臨床肺炎克雷伯桿菌分離株HS092839也被列入研究。通過接合試驗，一個70kb的質粒被成功轉移到受體菌大腸桿菌J53中。PCR和Southern blot試

14、驗證實了blaKPC-2基因存在于此質粒上。pHS102707全序列測序顯示質粒含有一個復制基因trfA，parA和parB等幾個質粒穩(wěn)定性基因，一套毒素抗毒素系統(tǒng)蛋白基因higA和higB，抗限制內切酶基因klcA和klcB，兩套Ⅳ型分泌系統(tǒng)。在復制蛋白基因trfA的3'末端的質粒穩(wěn)定模塊中插入了一個攜帶blaKPC-2基因的Tn1721-Tn3樣復合轉座子。在pHS102707和pHS112625中，一個含有fosA3基因的復合轉座