1、血藍(lán)蛋白(hemocyanin，HMC)是位于節(jié)肢動(dòng)物（螯肢類(lèi)、甲殼類(lèi)、多足類(lèi)和蜘蛛類(lèi)）和軟體動(dòng)物（腹足類(lèi)和頭足類(lèi)）血淋巴中的含銅呼吸蛋白。一般認(rèn)為，血藍(lán)蛋白的主要生物學(xué)功能與機(jī)體內(nèi)的輸氧有關(guān)，有意思的是，近年來(lái)學(xué)者們發(fā)現(xiàn)軟體動(dòng)物血藍(lán)蛋白還具有抗腫瘤活性。然而，迄今為止，對(duì)蝦血藍(lán)蛋白及其功能性肽段是否具有抗腫瘤活性尚不清楚。為此，本研究以凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白及其小分子合成肽（HMC-P）為研究對(duì)象，在課題組已有研究基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步采用細(xì)胞

2、生物學(xué)、分子免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等策略對(duì)其進(jìn)行了較為深入的研究，所獲主要研究結(jié)果如下：
　　1、對(duì)蝦血藍(lán)蛋白抗腫瘤活性
　　1）體外水平
　　課題組前期采用Sulfordmaine B(SRB)、DNA ladder、蛋白質(zhì)組學(xué)和熒光定量PCR等技術(shù)發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦血藍(lán)蛋白對(duì)HeLa細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖抑制和潛在促凋亡作用。在此基礎(chǔ)之上，本論文進(jìn)一步檢測(cè)血藍(lán)蛋白刺激HeLa細(xì)胞后其內(nèi)部活性氧（ROS）、線粒體膜電位以及C

3、aspase-3/9酶活性等的變化情況。結(jié)果表明，20-100μg/mL（Caspase-3/9酶活性檢測(cè)：20-60μg/mL）血藍(lán)蛋白與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，HeLa細(xì)胞可發(fā)生明顯的ROS爆發(fā)現(xiàn)象，線粒體膜電位顯著降低，Caspase-3/9的酶活性明顯上升，與陰性對(duì)照相比，均存在顯著性（p<0.05）或極顯著性差異（p<0.01）。由此推測(cè)，對(duì)蝦血藍(lán)蛋白體外抗腫瘤活性的作用機(jī)制可能為線粒體介導(dǎo)的程序性凋亡機(jī)制。
　　

4、2）體內(nèi)水平
　　在上述研究基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步以S180荷瘤小鼠為腫瘤模型，采用腹腔注射的方法探索血藍(lán)蛋白體內(nèi)抗腫瘤活性情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-6 mg/kgbw/d劑量血藍(lán)蛋白處理荷瘤小鼠8天后，S180實(shí)體瘤的生長(zhǎng)得以明顯的抑制，其中中劑量組（4mg/kgbw/d）抑瘤率為49％，與模型組和對(duì)照組（BSA）相比，其抑瘤率、瘤體積、肝指數(shù)、脾指數(shù)等均存在顯著性差異（p<0.05）或極顯著性差異（p<0.01）。
　　生化指標(biāo)結(jié)果

5、顯示，實(shí)驗(yàn)組血清和肝臟中的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量顯著上升或下降，其中，血藍(lán)蛋白中劑量組（肝臟MDA除外）與模型組和對(duì)照組（BSA）相比，存在極顯著性差異（p<0.01）。
　　非特異性免疫功能分析發(fā)現(xiàn)，血藍(lán)蛋白各劑量組均可以顯著提高小鼠血清中的TNF-α水平、NK細(xì)胞殺傷活性和脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，與模型組和對(duì)照組（BSA）相比，均存在顯著性差異（p<0.05）或極顯著性差異（p<0.01）。
　

6、　HE切片病理組織學(xué)分析表明，與模型組和對(duì)照組（BSA）相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞排列松散、細(xì)胞變圓變小、腫瘤組織出現(xiàn)較大面積壞死灶和纖維化組織結(jié)構(gòu)。
　　這些研究結(jié)果說(shuō)明，血藍(lán)蛋白不僅對(duì)S180荷瘤小鼠具有明顯抗腫瘤活性，而且對(duì)機(jī)體還有一定的保護(hù)效果。
　　2、對(duì)蝦血藍(lán)蛋白功能性肽段抗腫瘤活性
　　基于課題組前期發(fā)現(xiàn)12種對(duì)蝦血藍(lán)蛋白功能性肽段（命名為HMC-P）對(duì)6種病原菌具有抑菌活性的研究結(jié)果，本研究進(jìn)一步采用SRB、

7、DNA Ladder、DAPI染色、Annexin V-FITC/PI雙熒光染色等技術(shù)對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行了初步的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種（B10、B11和S7）HMC-P（50μg/ml）分別對(duì)HeLa、EC109細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制活性，其抑制率為40%-53%；該3種HMC-P處理HeLa細(xì)胞24h后，可使細(xì)胞產(chǎn)生明顯的DNA片段化，同時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞變圓、皺縮、形成核小體，并出現(xiàn)細(xì)胞膜外翻現(xiàn)象。由此說(shuō)明，對(duì)蝦血藍(lán)蛋白功能性肽段應(yīng)該同樣