1、目的：人們對側(cè)支血管生長機制的認識，經(jīng)過數(shù)十年的努力，已經(jīng)取得了很大的進展，但仍有許多問題需待深入的研究。本實驗采用動靜脈短路誘導(dǎo)側(cè)支血管生長的模型和平滑肌細胞的體外培養(yǎng)模型，研究了髂外動脈的重塑、側(cè)支血管MCP-1的表達與巨噬細胞浸潤之間的關(guān)系，從組織水平層面探討了巨噬細胞對側(cè)支血管生長的作用，以及細胞外基質(zhì)降解和細胞基質(zhì)成分對平滑肌細胞粘著斑激酶的表達和增殖的影響。 方法: 1．動物模型的制備 24只重3-4

2、kg成年大白兔，戊巴比妥鈉進行麻醉(138 mM/Kg，腹腔注射)暴露股動脈，進行雙側(cè)股動脈結(jié)扎和單側(cè)股動脈結(jié)扎，并將一側(cè)結(jié)扎的股動脈遠側(cè)端經(jīng)側(cè)-側(cè)吻合連接到伴行的股靜脈上。動物在相應(yīng)的存活時間點后處死，快速取樣，液氮中冷凍，然后用組織媒介劑(OCT復(fù)合物)包埋，貯存在-80℃待用。在單側(cè)股動脈結(jié)扎的動物未結(jié)扎側(cè)者為對照組，在雙側(cè)股動脈結(jié)扎的動物，未行股動-靜脈吻合側(cè)為對照組。 2．細胞培養(yǎng)模型 原代培養(yǎng)的兔主動脈平滑肌

3、細胞采用酶消化獲得。細胞培養(yǎng)液用199培養(yǎng)基和20％的胎牛血清，取第5代或6代的細胞用于實驗。對平滑肌粘著斑激酶及增殖的影響采用纖維連接蛋白(FN)和層粘連蛋白(LN)和Matrigel基膜成分三種材料。主要操作步驟是：12孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)放置直徑為18毫米的圓形蓋玻片，室溫下濃度為5ug/cm<'2> LN或者FN孵育2小時，然后吸出剩余液，并仔細清洗，平滑肌細胞種植到頂層，在37℃和5％CO<,2>的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，直到細胞密度

4、達到75％為止。Matrigel基膜基質(zhì)膠的制備按公司提供的說明書進行。平滑肌細胞種植在膠內(nèi)，然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。對于Brdu標記實驗，當平滑肌細胞生長密度達到75％左右時，按照公司提供的說明書加入Brdu，細胞培養(yǎng)1小時后進行免疫熒光檢測。 3．免疫熒光檢測 組織或培養(yǎng)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達的檢測均按常規(guī)的免疫熒光程序進行。側(cè)支血管組織檢測的蛋白質(zhì)有RAM11(巨噬細胞的標記物)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，細胞粘附

5、分子(ICAM和VCAM)和Ki67(細胞增殖標記物)；另外部分實驗骨骼肌用actin-phalloidin(FITC標記)直接顯色，毛細血管用LectinBS1(TITC標記顯色)。培養(yǎng)的平滑肌細胞的蛋白質(zhì)檢測包括粘著斑激酶(FAK)和磷酸化的粘著斑激酶(FAKpy397)。上述實驗中細胞核的染色根據(jù)需要分別采用7-AAD和TOFO3兩種細胞核的熒光染料。所有免疫熒光染色切片用Leica共聚焦顯微鏡拍照。 4．定量分析

6、 免疫熒光強度的定量測量用LeicaTCS SP共聚焦顯微鏡上配置的定量測量軟件完成，在整個測量過程中灰度值設(shè)定在0-255 Pixel強度水平。測量數(shù)據(jù)用SPSS軟件作統(tǒng)計分析。 免疫陽性細胞的計數(shù)也是在Leica共聚焦顯微鏡下完成，細胞計數(shù)在40X物鏡下進行，同時含有被檢測蛋白質(zhì)的陽性產(chǎn)物和細胞核染色的細胞計為陽性細胞。陽性細胞和所有細胞核之比為被檢測物質(zhì)的陽性率，測量結(jié)果用SPSS軟件作統(tǒng)計分析。 小結(jié):

7、1．本實驗在動靜脈短路模型中觀察到髂外動脈的重塑以及在小腿處觀察到?jīng)]有側(cè)支血管的生長但有毛細血管發(fā)生的事實，為“血流切應(yīng)力是側(cè)支血管生長驅(qū)動力”的觀點提供了新的實驗依據(jù)，同時也進一步證明了缺血只能誘導(dǎo)毛細血管生成而非側(cè)支血管生長。 2．在體實驗揭示了MCP-1在側(cè)支血管的表達以及巨噬細胞浸潤的時間模式以及巨噬細胞與細胞外基質(zhì)的降解和細胞增殖的密切關(guān)系。從組織學(xué)和細胞水平上為巨噬細胞對側(cè)支血管的生長作用提供了重要的形態(tài)學(xué)證據(jù)。