1、目的:探討去神經(jīng)支配對大鼠/兔后肢股動脈結(jié)扎誘導的側(cè)支血管生長的影響及其可能的機制，豐富和完善側(cè)支血管生長機制的理論，為缺血性疾病的治療尋找促側(cè)支血管生長新的途徑。
　　 方法:動物模型:成年SD健康大鼠52只和8只新西蘭大白兔，切斷右側(cè)坐骨神經(jīng)，存活1W后重新對動物進行麻醉，在腹股溝的深面暴露股動脈三角區(qū)域，將股動脈分離，在股深動脈的稍下方采用雙結(jié)扎法結(jié)扎股動脈，同時在右側(cè)股深動脈發(fā)出處用10％的苯酚溶液涂擦將結(jié)扎股動脈近側(cè)端

2、的分支神經(jīng)損毀，然后再切斷右側(cè)股神經(jīng)，左側(cè)僅行單純股動脈結(jié)扎，建立大鼠/兔后肢股動脈結(jié)扎和后肢股動脈結(jié)扎結(jié)合坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)切除誘導側(cè)支血管生長模型;單純?nèi)ド窠?jīng)組除不結(jié)扎股動脈外，其余步驟同上;
　　 實驗方法及檢測指標:第一部分:研究去神經(jīng)支配對大鼠后肢缺血誘導側(cè)支血管生長的影響。上述32只大鼠動物模型分別存活1W和8W（分別為側(cè)支血管生長活躍期和成熟期），采用血管造影、組織學以及共聚焦免疫熒光術(shù)，觀察保留和去神經(jīng)支配對大鼠后

3、肢側(cè)支血管生長的影響;
　　 第二部分:研究去神經(jīng)支配對大鼠/兔后肢股動脈結(jié)扎誘導的側(cè)支血管生長激活的影響。利用上述模型中的12只實驗大鼠和8只實驗新西蘭大白兔，通過共聚焦免疫熒光術(shù)，觀察去神經(jīng)支配對大鼠/兔后肢側(cè)支血管生長過程中與炎癥密切相關(guān)的細胞因子如ICAM（細胞粘附分子）、VCAM（血管細胞粘附分子）、MCP-1（單核細胞趨化因子）和CD11b（單核/巨噬細胞標志物）以及Ki67（細胞增殖標志物）、Vimentin（外膜

4、成纖維細胞和平滑肌合成表型標志物）、MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）和eNOS（一氧化氮合酶）等表達的影響;
　　 第三部分:研究神經(jīng)對側(cè)支血管生長的可能作用機制，主要從在體和離體兩方面進行研究:①動物實驗:觀察去神經(jīng)支配后神經(jīng)分泌素(Secretoneurin，SN)在側(cè)支血管生長中的表達變化;同時利用上述大鼠動物模型中的8只以10μg/d的SN劑量在大鼠股動脈結(jié)扎側(cè)后肢股薄肌處進行局部注射，存活1W，通過共聚焦免疫熒光術(shù)，觀

5、察SN對側(cè)支血管生長過程中細胞增殖和單核/巨噬細胞浸潤的影響。②細胞培養(yǎng):鑒于血管平滑肌細胞是側(cè)支動脈血管的主要細胞以及在側(cè)支血管靠近外膜處的平滑肌細胞表達VCAM和MCP-1等，故采用大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞體外培養(yǎng)，取5-6代細胞用于實驗研究，平滑肌細胞經(jīng)特異性的抗平滑肌細胞肌動蛋白(α-SM actin)抗體鑒定，分為正常對照組、1ng/ml SN組、10ng/ml SN組、100ng/ml SN實驗組，SN作用24h后，運用M

6、TT比色法檢測不同濃度的SN對血管平滑肌細胞增殖活性的影響，并采用免疫印跡和免疫細胞化學法檢測SN對血管平滑肌細胞表達VCAM-1（血管細胞粘附分子）和MCP-1（單核細胞趨化因子）的影響。
　　 結(jié)果:第一部分:單純股動脈結(jié)扎側(cè)，血管造影可見明顯密集呈網(wǎng)狀分布的側(cè)支血管，組織學和共聚焦免疫熒光術(shù)可見血管壁各層結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑，生長的側(cè)支血管管腔增大，管壁較薄，呈外向性生長方式的特征，且骨骼肌纖維形態(tài)完好，排列規(guī)則;股動脈結(jié)扎加去神

7、經(jīng)側(cè)，側(cè)支血管的數(shù)目雖然比正常增多，但明顯少于單純股動脈結(jié)扎側(cè);側(cè)支血管管腔狹窄，管壁變厚，骨骼肌肌纖維出現(xiàn)降解，體積減少，肌間隙增寬。
　　 第二部分:去除神經(jīng)支配后，側(cè)支血管粘附分子ICAM和VCAM在血管內(nèi)皮的表達下降不明顯，但外膜和靠近外膜的中膜處VCAM和MCP-1的表達則明顯降低，與此相對應單核/巨噬細胞（CD11b陽性細胞）的數(shù)目在血管壁明顯減少;另外，和單純股動脈結(jié)扎相比，在側(cè)支血管生長活躍期外膜成纖維細胞的數(shù)目

8、較少，MMP-2的表達較低，而在側(cè)支血管成熟期成纖維細胞數(shù)目增加，但中膜Vimentin及eNOS的表達一直呈高水平。
　　 第三部分:①單純股動脈結(jié)扎側(cè)，SN免疫陽性神經(jīng)纖維主要表達在側(cè)支血管外膜，去除神經(jīng)后SN的表達明顯減少至消失;股動脈結(jié)扎+局部注射SN后，側(cè)支血管細胞增殖的數(shù)目和單核/巨噬細胞的表達均明顯增加。②用抗平滑肌細胞肌動蛋白的抗體對培養(yǎng)的血管平滑肌細胞的純度進行鑒定，98％的細胞為α-SM actin免疫陽性細

9、胞。MTT比色法發(fā)現(xiàn)不同濃度的SN作用后，血管平滑肌細胞的增殖活性均明顯增強;免疫細胞化學和免疫印跡均顯示SN能刺激血管平滑肌細胞VCAM和MCP-1的表達明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論:①在大鼠/兔后肢股動脈結(jié)扎誘導的側(cè)支血管生長模型，去除神經(jīng)支配后，側(cè)支血管的數(shù)目減少，血管管壁增厚，管腔變窄呈內(nèi)向性的生長方式，導致血流減少供血不足，造成骨骼肌的缺血和損害;②去神經(jīng)支配導致血管壁特別是外膜SN和細胞因子(VCAM和MCP-1)的表達下