1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文P02基因的全長cDNA克隆及其過表達對肝細胞株生物學(xué)行為的影響姓名：高天慧申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：消化內(nèi)科指導(dǎo)教師：段芳齡2003.5.1筇州大學(xué)醫(yī)學(xué)既2003年博士研究生學(xué)位論ZP02基因的生忙c嘶^克璉及其n舞迂對軒紐瞻攤生物學(xué)1彳為的彩響DEGFP—N3P02重構(gòu)體，并將此重構(gòu)體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝癌細胞系SKMC772l和正常肝細胞系L—D2中，觀察PD2過表達對】i千細胞系生物學(xué)行為的影響。方法根據(jù)P02EST序

2、列3’末端的polyA結(jié)構(gòu)和“AAT從A”的加尾信號，推測P02EST帶有3’末端，并據(jù)此設(shè)計引物，通過逆轉(zhuǎn)錄酶在RNA5’末端的模板轉(zhuǎn)換機制(妯itchlngMechaniSIllAts、end0fR＼ATranscriPtSMART)，采用cDNA末瑞快速手r增(rapidamplificatioilofeDNAendsRACE)技術(shù)在肝細胞癌組織中擴增P02的5’和3’末端，用TA克隆的方法將擴增產(chǎn)物連入克隆載體pTAdv中用氨芐

3、青霉素和藍白斑實驗雙重篩選含插入子的陽性克隆，隨機挑取5個克隆，用堿裂解法提取質(zhì)粒用PCR和酶切鑒定目的片段的插入，用雙脫氧鏈末端終止法進行雙向測序，將測序結(jié)果用VecScreen在線軟件篩除序列兩側(cè)所帶的裁體序列和外加接頭序列用BLAST對隨機測序的j個克隆進行序列分斤比較序列之間有否差異，并搜索由j’RACE所得的序列與已知的P02EST之間的交疊序列，從j’RACE所得的序列中去除這段重疊序列后，與已知的P02EST拼接根據(jù)Koz

4、ak規(guī)則，判定該拼接序列是否符合全長cDNA的特點，用BLAST在Genbank中搜索P02全長cbNA的同源序列，生物軟件預(yù)測P02的oRF，以及蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能、亞細胞定位和理化性質(zhì)。通過PCR的方法在P02ORF兩側(cè)添加EcoRI和BamHI的識別序列而將其定向插入帶有綠色熒光蛋白際簽的真核報告表達載體pEGFP—N3中構(gòu)成含有P02ORF插入子的重構(gòu)體pEBFP—N3P02卡那霉素篩選陽性克隆，堿裂解法抽提質(zhì)粒，雙酶切和PC

5、R法鑒定目的片段的插入Sanger法測序，VecScreen和BLAST分析測序結(jié)果，鑒定目的片段的正確插入(包括插入方向、插入部位和插入序列的正確無誤)r用QIAGEN超純質(zhì)粒抽提試劑盒抽提pEGFPN3P02和pEGFP—N3通過1ipofectAMINE分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞系s柵c一7721和正常肝細胞系L02，在24小時內(nèi)連續(xù)轉(zhuǎn)染3次，以轉(zhuǎn)染pEGFP—N3P02的細胞為實驗組，以轉(zhuǎn)染pEGFPN3的細胞為對照組，在熒光顯微鏡下通過

6、綠色熒光標簽觀察P02所表達蛋白在肝系細胞內(nèi)的亞細胞定位，監(jiān)測表達效率，通過RT—PCR、MTT實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、細胞周期分析，比較轉(zhuǎn)染pEGFP—N3P02的實驗組與轉(zhuǎn)染pEGFP—N3的對照組之間的差別。結(jié)果37RACEPCR產(chǎn)物大小在400bp左右，從3’RACE引物在EST序列中的位置，至EST序列的3’末端加上通用引物的長度，也在400bp左右，根據(jù)已知的P02EST序列3’末端含有加尾信號和polyA結(jié)構(gòu)，從而判定該