1、目的:骨關節(jié)炎(OA)是一種常見的,影響大眾尤其是中老年人群正?；顒拥闹饕P節(jié)疾病,給個人和社會帶來了巨大的身心和經(jīng)濟上的負擔。本病的發(fā)病趨勢沒有明顯的種族和地域性,發(fā)病機制涉及形態(tài)學,生化,代謝等多方面的改變。在骨關節(jié)炎的病理改變中,大量炎性介質(zhì)的釋放是造成局部關節(jié)改變的重要因素。這些促炎性因子中,IL-1,TNF無疑扮演了重要的角色。針對這些細胞因子的生物學功能研制開發(fā)了一系列的治療手段。隨著該領域研究的進展,骨關節(jié)炎的病理改變中滑

2、膜組織所起到的作用也得到了越來越多的重視?；そM織釋放的炎性介質(zhì)造成關節(jié)內(nèi)軟骨基質(zhì)的降解,加重關節(jié)局部炎性改變。而其本身的過度增生也是導致關節(jié)本身退化、局部腫脹的重要因素之一,并引發(fā)了包括疼痛以及局部功能障礙等一系列臨床表現(xiàn)。本實驗中,我們使用基因治療的方法,利用重組腺相關病毒載體(rAAV),將外源性抑炎性因子基因聯(lián)合自殺基因?qū)塍w外培養(yǎng)的滑膜細胞,試圖減少滑膜細胞促炎性因子的釋放并抑制過度增生的滑膜細胞,以此來達到治療骨關節(jié)炎的目的

3、。
　　 方法:利用rAAV,將抗炎因子白介素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)聯(lián)合單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)自殺基因系統(tǒng)引入體外培養(yǎng)的滑膜細胞,觀察其在抑制促炎性因子分泌以及誘導靶細胞死亡以控制滑膜細胞增生的效果。所有實驗分組除非特殊說明否則均為:A組導入IL-1Ra基因,B組導入HSV-tk基因,C組導入IL-1Ra聯(lián)合HSV-tk基因,D組為對照組,轉(zhuǎn)染含空質(zhì)粒的rAAV。首先,利用攜帶報告基因EGFP的病毒載體轉(zhuǎn)

4、染滑膜細胞以此來觀測該病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細胞的情況并確定最佳的轉(zhuǎn)染條件。涉及更昔洛韋(GCV)的細胞毒作用,分別設置HSV-tk(-)組和HSV-tk(+)組等兩組獨立實驗;GCV的濃度分5組為0.1、1、10、100、1000(單位:μg/ml);設置時間段為24小時至96小時,4個時間段進行檢測,時間間隔為24小時,利用MTT檢測細胞生長抑制情況。自殺基因的旁觀者效應同樣采用MTT。目的基因,包括:IL-1Ra、IL-1β、TNF

5、-α、HSV-tk,其表達量使用了real-time PCR進行分析,并用相對定量的方法—2-ΔΔCT進行表達量的分析。涉及相關因子包括:IL-1Ra、IL-1β、INF-α的含量水平的表達則利用ELISA進行檢測。最后,利用流式細胞術檢測由自殺基因誘導的靶細胞凋亡情況。采用Annexin V-FITC-PI雙染法進行滑膜細胞凋亡的測定。
　　 結果:首先,就自殺基因HSV-tk以及其產(chǎn)生的旁觀者效應來看,結果發(fā)現(xiàn):HSV-tk

6、(-)組細胞生長抑制情況基本呈濃度依賴的正相關,但不同GCV濃度以及不同時間段對比缺乏統(tǒng)計學差異;反觀HSV-tk(+)組,除去表現(xiàn)出的GCV濃度依賴關系外,不同時間段以及不同藥物劑量分組間有統(tǒng)計學差異。根據(jù)該實驗結果,選取了GCV濃度為100μg/ml,給藥后72小時為后續(xù)實驗的基礎條件。旁觀者效應的MTT分析中發(fā)現(xiàn):HSV-tk(+)細胞所占比例為50％時細胞生長抑制率為77.31±5.44％。通過分析認為該自殺基因陽性細胞比例使實

7、驗結果最優(yōu)化。結果以平均值±S.D表示,n=3,P＜0.05。在real-time PCR對目的基因表達量的檢測中,IL-1Ra,基因的表達量在A組和C組分別為66.49±10.85,117.63±21.88,而未導入IL-1Ra基因的B組為24.42±5.83。IL-1β的表達量在A、B、C三組分別下降至0.028±0.017,0.102±0.034和0.017±0.005。同樣,自殺基因HSV-tk在被導入了該基因的B、C兩組表達顯

8、著,分別是252.663±53.673和513.867±120.821。而未導入該基因的A組表達量為6.720±2.429.然而,這種統(tǒng)計學的改變在TNF-α的基因表達上并不明顯,三組實驗組A、B、C的表達量分別是3.563±2.511,5.523±2.285,1.017±0.162。結果以平均值+SEM來表示,n=3,P＜0.05。相似的趨勢在蛋白水平的測定上也可發(fā)現(xiàn),通過EIASA的檢測,IL-1Ra的水平在A組達到56.723±6

9、.563 pg/ml,B組為30.790±8.431 pg/ml C組76.277±10.380pg/ml,而對照組D組為11.467±3.657pg/ml。相應的,IL-1β在A組的水平下降到14.343±4.232 pg/ml,B組為21.300±5.112 pg/ml,C組為6.534±2.353 pg/ml,相比較D組則是52.287±9.636 pg/ml。同樣,TNF-α通過ELISA檢測也缺乏相應的變化。其水平在三個實驗組

10、A、B、C分別為9.733±5.804 pg/ml,14.247±2.255 pg/ml,6.527±3.785pg/ml,而在對照組D則為4.637±2.799 pg/ml。統(tǒng)計結果以平均值±SEM表示,n=3。對于自殺基因誘導細胞死亡的過程,72小時給予GCV后,倒置顯微鏡下可觀察到大批貼壁細胞漂浮在培養(yǎng)液中,利用流式細胞術檢測,在導入HSV-tk的B、C兩組,細胞的凋亡率分別為65.70％和69.40％,而在未導入HSV-tk的A