1、過(guò)度的重金屬錳(Mn)接觸通常會(huì)誘發(fā)慢性神經(jīng)中毒,產(chǎn)生帕金森樣綜合癥狀。該癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前臨床上仍缺乏有效的治療手段。因此,迫切需要建立安全并有效的治療錳誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的方案。對(duì)氨基水楊酸(PAS)自1959年以來(lái)作為二線藥物在臨床上被用于治療結(jié)核病。最近的報(bào)道顯示,在臨床試驗(yàn)中PAS能有效緩解錳誘導(dǎo)的慢性神經(jīng)中毒癥狀。然而,目前對(duì)PAS及其主要代謝物N-乙酰對(duì)氨基水楊酸(AcPAS)的腦內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)特性尚不明確。本文采用體內(nèi)外模型對(duì)

2、PAS和AcPAS在大鼠腦內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)及ADME進(jìn)行了研究,為兩者的臨床應(yīng)用,以及研發(fā)治療錳神經(jīng)中毒的新藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1.同時(shí)測(cè)定PAS及其主要代謝物的HPLC-熒光法的建立
　　目的:建立快速、有效的分析方法以準(zhǔn)確定量血漿、腦脊液(CSF)和腦組織中的PAS及其主要代謝物AcPAS。
　　方法:生物樣品經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)沉淀,上清液中各組分用C18柱通過(guò)流動(dòng)相梯度洗脫分離,最后進(jìn)行熒光檢測(cè),同時(shí)測(cè)定PAS和A

3、cPAS的含量。
　　結(jié)果:PAS,AcPAS和內(nèi)標(biāo)化合物在生物樣本中的測(cè)定不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾?？瞻籽獫{中PAS和AcPAS在0.05～500μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,定量下限均為50ng/mL;腦組織勻漿和CSF中PAS和AcPAS在0.017～166.7μg/g濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,定量下限均為17ng/g。生物樣本中PAS和AcPAS的日內(nèi)和日間精密度RSD％值在1-8%之間,準(zhǔn)確性在93至109%之間。P

4、AS在血漿和腦勻漿液中的絕對(duì)回收率分別為64-67%和67-69%,在CSF中絕對(duì)回收率為94-97%; AcPAS在血漿,腦組織和人工腦脊液的絕對(duì)回收率分別為65-66%,77-85%和94-97%。樣品在長(zhǎng)期儲(chǔ)存,反復(fù)凍融過(guò)程中能保持穩(wěn)定。
　　結(jié)論:本研究建立了便捷而且有效的方法定量測(cè)定大鼠血漿、CSF和腦組織中的PAS和AcPAS.該方法靈敏度高、重復(fù)性好、能準(zhǔn)確專屬地定量分析生物樣品中的藥物。
　　2.藥物在腦內(nèi)分

5、布、組織蛋白結(jié)合和代謝研究
　　目的:評(píng)價(jià)PAS和AcPAS從大鼠血液進(jìn)入腦部不同區(qū)域的能力,為闡明其臨床解毒機(jī)制和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。研究PAS和AcPAS與血漿和腦組織蛋白結(jié)合作用,以及PAS是否可能被分布于靶區(qū)域的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶1(NAT1)生物轉(zhuǎn)化為AcPAS,預(yù)測(cè)影響PAS和AcPAS在大鼠腦部的吸收、分布和消除的可能因素。
　　方法:雄性大鼠股動(dòng)脈給予200mg/kg PAS,在45min的時(shí)間點(diǎn)采集CS

6、F、血漿和各個(gè)腦區(qū)組織,以5-氨基水楊酸為內(nèi)標(biāo),RP-HPLC測(cè)定給藥后PAS和AcPAS在不同組織中的濃度。分離和純化腦組織樣品中疑似為代謝物的HPLC組份,并采用HPLC、1H NMR等方法鑒定了其結(jié)構(gòu)為AcPAS.通過(guò)超濾離心法測(cè)定PAS和AcPAS在血漿和6個(gè)所選腦區(qū)的蛋白結(jié)合率。利用體外孵育法觀察藥物在腦部的代謝程度。
　　結(jié)果:除脈絡(luò)叢和CSF外,AcPAS在大部分測(cè)定腦區(qū)的濃度高于PAS,腦毛細(xì)血管壁中只能檢測(cè)到Ac

7、PAS. PAS的濃度在脈絡(luò)叢最高,其次為CSF,在丘腦中最低;AcPAS的濃度在脈絡(luò)叢最高,其次為海馬,在CSF中最低。血漿和腦組織中,超過(guò)90% PAS分子以游離形式存在,而非結(jié)合的AcPAS的比例在80-87%之間。大鼠腦內(nèi)的NAT1在體外代謝孵育實(shí)驗(yàn)中不顯示生物學(xué)活性,無(wú)法將PAS代謝生成AcPAS.
　　結(jié)論:PAS給藥45min后,PAS和AcPAS均能在腦內(nèi)被檢測(cè)到,且腦組織中AcPAS的含量高于PAS。PAS主要以

8、游離的形式存在于血漿和腦組織中。較少部分AcPAS與腦組織蛋白結(jié)合。PAS給藥后大鼠腦內(nèi)的AcPAS來(lái)源于血液循環(huán)跨腦屏障吸收,而非在腦部代謝生成。
　　3.對(duì)氨基水楊酸及其主要代謝物在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:全面地揭示大鼠腦部不同區(qū)域?qū)AS和AcPAS的攝取程度和處置規(guī)律,獲得PAS及AcPAS在腦中分布及腦內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
　　方法:利用已建立的HPLC-熒光法,評(píng)價(jià)大鼠股動(dòng)脈注射PAS后母體藥物及

9、其代謝物的血漿藥物動(dòng)力學(xué),腦脊液藥物動(dòng)力學(xué)和腦不同組織內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)特征。PAS和AcPAS在大鼠體內(nèi)不同體液或組織中的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)通過(guò)DAS2.0軟件計(jì)算獲得。
　　結(jié)果:大鼠股動(dòng)脈給予高劑量的PAS后,母體藥物在血漿中的藥物動(dòng)力學(xué)符合二室模型,半衰期為34min。代謝物AcPAS在血漿達(dá)峰時(shí)間為86min。PAS在CSF中在17min達(dá)峰,并在4h內(nèi)被基本消除。AcPAS在CSF中達(dá)峰時(shí)間為44min, PAS在血漿中的AUC

10、0-∞值是AcPAS的3倍,在CSF中的AUC0-∞值是AcPAS的7.5倍。脈絡(luò)叢中PAS和AcPA濃度相對(duì)較高,Cmax值分別為42.81±4.90μg/g和30.744±3.50μg/g。所測(cè)定的腦區(qū)域中,AcPAS的半衰期比PAS長(zhǎng)。除脈絡(luò)叢以外,AcPAS在各個(gè)腦區(qū)的AUC0-∞和Cmax值均高于PAS,提示代謝物透過(guò)腦屏障并進(jìn)入腦不同區(qū)域的能力高于其母體化合物。
　　結(jié)論:PAS與AcPAS顯示不同的藥物動(dòng)力學(xué)特征,且

11、單個(gè)化合物在血漿、CSF和腦不同區(qū)域的藥物動(dòng)力學(xué)行為也存在較大差異。由PAS和AcPAS的藥物動(dòng)力學(xué)-藥效學(xué)相關(guān)性提示,AcPAS對(duì)螯合消除腦內(nèi)錳離子起到了更為重要的作用。
　　4.對(duì)氨基水楊酸及其主要代謝物體外轉(zhuǎn)運(yùn)研究
　　目的:理解PAS及AcPAS在血腦屏障和血腦脊液屏障中可能的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
　　方法:采用MDCK-MDR1細(xì)胞作為模擬血腦屏障藥物吸收的體外模型;采用Z310細(xì)胞作為模擬血腦脊液屏障藥物吸收的

12、體外模型,應(yīng)用二室Transwell轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)開(kāi)展體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)PAS及AcPAS在腦屏障的吸收轉(zhuǎn)運(yùn),以及PAS對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白(P-gp)的抑制作用。
　　結(jié)果:PAS在MDCK及MDCK-MDR1細(xì)胞單層中的表觀滲透系數(shù)均＜1×106cm/s,提示其在血腦屏障透過(guò)較差。PAS在MDCK-MDR1細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)存在顯著的外排現(xiàn)象,凈外排率為3.8,且這種外排能被P-gp的經(jīng)典抑制劑維拉帕米和奎尼丁抑制,且PAS能

13、刺激MDCK-MDR1細(xì)胞囊膜上ATP酶的活性,證明PAS是P-gp的底物,提示P-gp是導(dǎo)致PAS在腦部含量較低的主要原因之一。AcPAS透過(guò)MDCK-MDR1細(xì)胞不受P-gp外排作用的影響。以羅丹明123(R123)作為P-gp的探針底物,證實(shí)PAS能影響MDCK-MDR1細(xì)胞單層中由P-gp介導(dǎo)的R123外排,半數(shù)抑制濃度IC50值為10.29μg/mL,提示PAS對(duì)P-gp有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。永生化脈絡(luò)膜上皮Z310細(xì)胞的雙室Tr

14、answell體外轉(zhuǎn)運(yùn)研究發(fā)現(xiàn)兩種化合物在血腦脊液屏障的攝取或外排沒(méi)有顯著性差異,均傾向于從血液側(cè)被攝取進(jìn)入CSF側(cè)。MRP1抑制劑MK-571能將AcPAS的外排效率抑制到陽(yáng)性對(duì)照組的一半。
　　結(jié)論:MDCK-MDR1細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)運(yùn)研究結(jié)果顯示PAS為P-gp的底物,高劑量的PAS使血腦屏障P-gp的轉(zhuǎn)運(yùn)作用達(dá)到飽和,是PAS在腦組織中急劇增加后被迅速消除的主要原因。AcPAS不是P-gp的底物,能夠從血液側(cè)透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦

15、實(shí)質(zhì)組織間液,是AcPAS在腦組織中緩慢并穩(wěn)定增加,且在所測(cè)定的各個(gè)腦區(qū)濃度較高的主要原因。Z310細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)運(yùn)研究結(jié)果顯示脈絡(luò)膜上皮細(xì)胞上MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)AcPAS由CSF向脈絡(luò)叢外排,是AcPAS在CSF中濃度較低,但在脈絡(luò)叢中濃度較高的主要原因?？傊?大鼠股動(dòng)脈給予PAS后,血液中的PAS能透過(guò)血腦脊液屏障進(jìn)入CSF,進(jìn)而從腦組織間液中被血腦屏障外排回血液。PAS代謝物AcPAS透過(guò)血腦屏障在腦內(nèi)靶區(qū)域停留,最后可能從血腦脊