1、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星屬于第三代氟喹諾酮類藥物,因?yàn)樗鼈兤毡榫哂锌咕V廣、抗菌活性強(qiáng)、消化吸收好與其他種類抗菌藥物無交叉反應(yīng)等特點(diǎn),現(xiàn)已廣泛大量地應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)及臨床用藥上。由于其存在著潛在的毒副作用加上此類藥物的大量及不合理使用,使得氟喹諾酮藥物殘留所帶來的危害越來越受到關(guān)注,為了保障雞肉產(chǎn)品的安全,需要建立一種高效、靈敏的藥物殘留檢測技術(shù)。本研究采用了免疫分析法中的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法(Ci-ELISA),用左氧氟

2、沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星作為半抗原,制備出抗血清,分別建立Ci-ELISA去對雞組織中氟喹諾酮藥物殘留進(jìn)行檢測并研究其消除規(guī)律。主要結(jié)果如下： 1.左氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星人工抗原的合成鑒定及抗體的制備用N-羥基琥珀酰亞胺法把左氧氟沙星(LVL)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIF)、分別與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)制備免疫抗原；用氯甲酸異丁酯法把左氧氟沙星(LVL)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIF)分別與

3、雞卵清蛋白(OVA)偶聯(lián),制備包被檢測抗原,采用紫外掃描法對合成的抗原進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明：免疫抗原和包被抗原均成功制備,結(jié)合比LVL-BSA、ENR-BSA、CIF-BSA、LVL-OVA、ENR-OVA、CIF-OVA,依次為10.6、11.6、13.6、5.1、5.2、6.8。用三種人工免疫抗原LVL-BSA、ENR-BSA、CIF-BSA分別免疫家兔,制備出相應(yīng)的抗血清,用ELISA法進(jìn)行抗體效價(jià)檢測,抗血清中的抗體效價(jià)均達(dá)到1:

4、2112以上,說明抗血清的制備是成功的。 2.三種氟喹諾酮類藥物殘留Ci-ELISA檢測方法的建立實(shí)驗(yàn)先對LVL、CIF、ENR進(jìn)行交叉反應(yīng)性的測定,測定結(jié)果表明,三種藥物與氟喹諾酮類藥物都具有一定的交叉反應(yīng),其中ENR與CIF的交叉反應(yīng)最大。通過對Ci-ELISA法實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化得到如下最佳反應(yīng)參數(shù)：最適包被抗原工作濃度分別為1: 200、1: 200、1: 400;抗LVL、ENR、CIF血清的最佳工作濃度為1: 3200、

5、1: 6400、1: 3200;最佳孵育時(shí)間為2h;酶標(biāo)二抗(羊抗兔 IgG-HRP)的稀釋度為1: 5000。在上述優(yōu)化的Ci-ELISA法反應(yīng)參數(shù)的基礎(chǔ)上,分別建立了LVL、ENR、CIF殘留檢測的Ci-ELISA法。具體結(jié)果如下:LVL檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=-0.2894X+0.0495(R2=0.9878),中值(IC50)為64ng/mL,最低檢測限(LOD)為10ng/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為10～1000ng

6、/mL;ENR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=-0.2186X+0.216(R2=0.9843),中值(IC50)為36ng/mL,最低檢測限(LOD)為10g/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為10～1000ng/Ml;CIF檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=-0.219X+0.1661(R2=0.9885),中值(IC50)為24ng/mL,最低檢測限(LOD)為10g/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為10～1000ng/mL。通過添加回收試驗(yàn)

7、,左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星藥物在雞肌肉、肝臟、腎臟組織中的平均添加回收率均在80％以上,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均低于15％,均達(dá)到了藥物殘留分析的要求。 3.Ci-ELISA檢測方法研究雞組織中三種氟喹諾酮類藥物殘留消除規(guī)律本研究是以左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星3種FQs藥物為對象,肉雞按30mg/kg灌服給藥,結(jié)果表明：3種FQs藥物在停藥96h后,在雞組織中,肌肉中的藥物濃度已經(jīng)低于檢測限,而肝臟、腎臟中仍可檢測到；停藥