1、　　目的：觀察天麻素對長春新堿誘導痛覺過敏模型大鼠的預防及治療作用,并研究其對大鼠脊髓背角星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化以及 TNFα、IL-1β 等炎性細胞因子表達的影響,探討其在脊髓水平的作用機制。
　　方法：(1) 建立化療誘導痛覺過敏模型的方法：挑選出痛閾合格的成年SD大鼠,隨機分為2組,分別為生理鹽水對照組和長春新堿模型組。模型組隔日一次腹腔注射長春新堿(125μg/kg),對照組同步注射生理鹽水(0.5ml/100g)

2、,以首次給藥當天為第一天(D1),給藥前測定一次痛閾值,給藥后于第2天開始隔日做行為學實驗,檢測大鼠機械刺激和熱刺激痛閾值。當模型組大鼠痛閾值明顯降低時,即模型建立成功,記錄給藥總次數(shù)。(2) 行為學方法觀察天麻素對化療誘導痛覺過敏的作用：取健康SD大鼠30只,隨機區(qū)組法分為5組,分別為生理鹽水對照組,長春新堿模型組,小、中、大天麻素劑量組(30mg/kg,60mg/kg,120mg/kg)。首先,建立化療誘導的痛覺過敏模型,即除對照組

3、用生理鹽水對照外,其它四組隔日腹腔注射VCR,共4次,模型建立成功后,于第9天藥物治療組開始腹腔注射天麻素,對照組和模型組用生理鹽水同步對照,分別于治療1-2周后,行為學方法檢測記錄大鼠的痛閾值變化。(3) 免疫組化法測定大鼠星形膠質(zhì)細胞活化的狀況：分組及處理方法同(2)。于末次治療第2天,用2%戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉大鼠,然后用4%多聚甲醛對大鼠行活體灌流,取大鼠脊髓腰膨大,固定、脫水、包埋處理,并做石蠟切片,采用免疫組化S

4、V法檢測星形膠質(zhì)細胞活化標志物GFAP的表達。(4)免疫熒光方法檢測大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞的活化狀況：分組及處理方法同(2) 。大鼠取材方法同(3),取出腰膨大后固定,蔗糖脫水,冰凍切片,免疫熒光技術檢測小膠質(zhì)細胞活化標志物物Iba-1的表達。(5) 酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠脊髓IL-1β和TNFα的表達變化：分組及處理同(2)。用天麻素治療1周后,于末次治療第2天,大鼠用20%烏拉坦(1ml/100g)深麻醉下斷頭處死。取出脊髓腰膨大處,加

5、入預冷的生理鹽水,用勻漿器按1：9(W/V)的比例制成10%的組織勻漿,于4℃離心機, 3500r/min 離心10min,提取上清液于-20℃凍存待測。采用ELISA方法進行測定。(6) MTT法檢測天麻素對長春新堿殺傷癌細胞的影響：將VCR按6.25、12.5、25、50、100、200、400、800μg/m l濃度加入含有乳腺癌細胞(MCF-7)的培養(yǎng)孔中,細胞濃度2-4×104,培養(yǎng)24小時,用噻唑藍 (MTT )比色法測定O

6、D值,計算細胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)；將天麻素按0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5mg/ml濃度單獨加入含有MCF-7的培養(yǎng)孔中,同時將VCR和天麻素聯(lián)合用于MCF-7,培養(yǎng)24小時,MTT法測定OD值,計算生存率。
　　結果：(1) 在行為學實驗中,實驗第8天化療誘導的痛覺過敏模型成功建立,用不同劑量天麻素治療模型大鼠1周后,治療組大鼠的機械和熱刺激痛閾值與模型組比較均有不同程度的提高(P

7、<0.05,P<0.01)。(2) 免疫組化實驗中,模型組的脊髓灰質(zhì)中可見GFAP表達明顯增強,提示星形膠質(zhì)細胞明顯活化,而治療組與模型組比較, GFAP表達明顯減弱。(3) 免疫熒光實驗中,模型組脊髓灰質(zhì)中Iba-1表達明顯增強,提示小膠質(zhì)細胞明顯活化,治療組與模型組比較,Iba-1的表達均有不同程度的減弱,表明天麻素可抑制小膠質(zhì)細胞的活化。(4)在酶聯(lián)免疫吸附實驗中,實驗第 8 天痛覺過敏大鼠模型成功建立,用不同劑量天麻素治療后,與

8、模型組比較,治療組大鼠的IL-1β和TNFα的表達明顯降低(P<0.01)。(5)在觀察天麻素對長春新堿殺傷癌細胞作用的影響實驗中,天麻素單獨加入含有MCF-7的培養(yǎng)孔后,對其生長無顯著的影響(P>0.05),天麻素和長春新堿同時加入含有MCF-7的培養(yǎng)孔后,天麻素對VCR殺傷癌細胞作用無顯著影響 (P>0.05)。
　　結論：天麻素可減輕長春新堿誘導的大鼠痛覺過敏反應,其減輕化療誘導痛覺過敏反應的機制,可能與其抑制脊髓背角星形