1、本研究選擇抗U1RNP抗體陽(yáng)性血清作為研究對(duì)象，檢測(cè)血清特異性抗HPAEC抗體，探討該抗體同抗U1RNP抗體之間的關(guān)聯(lián)性，并觀察其對(duì)HPAEC分泌RANTES的影響，在此基礎(chǔ)上分析抗HPAEC抗體在肺動(dòng)脈血管免疫損傷中的作用，以期闡明CTD患者PAH的發(fā)病機(jī)制，為更有效臨床治療藥物的研制開發(fā)提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、RNA-免疫沉降法(RNA-IPP)篩選抗U1RNP抗體陽(yáng)性血清 2mg seph

2、arose CL-4B蛋A A與500μl IPP緩沖液均勻混合后，加入10μl患者血清，4℃翻轉(zhuǎn)混合2h。血清抗體包被的cepharose顆粒用500μl IPP緩沖液沖洗3次后與細(xì)胞抗原反應(yīng)，抗原用Hela細(xì)胞制備(每個(gè)標(biāo)本6x10<'6>個(gè)細(xì)胞)。HeLa細(xì)胞加入0.3ml NET-2緩沖液中，經(jīng)超聲裂解后，收集細(xì)胞裂解液上清，加入400μlNET-2緩沖液，其中含有抗體包被的cephalose顆粒，4℃孵育2h。反應(yīng)后的顆粒，經(jīng)

3、NET-2緩沖液洗滌3次并離心后，加入270μl NET-2緩沖液，30μl 3M醋酸鈉溶液，15μl 20％SDS溶液，其中RNA經(jīng)phenol/chloroform/isoamyl alcohol(50：50：1)提取后用3倍體積的乙醇沉淀析出后，經(jīng)10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝膠電泳分離，最后通過銀染色顯影。 二、蛋白質(zhì)免疫印記雜交檢測(cè)血清特異性抗HPAEC抗體 (一)細(xì)胞抗原的制備HPAEC購(gòu)自日本KURABO公司

4、，經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基(HuMedi<'○R>-EG2)培養(yǎng)。使用前細(xì)胞用Trypsin/EDTA溶液自細(xì)胞培養(yǎng)瓶分離，中和液中和，PBS洗滌3次。HPAEC經(jīng)細(xì)胞裂解液(10mM Tris-Hcl，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1％Nonidet P-40，0.2％SDS，10mM NaF，2mM Na<,2>VO<,4>)裂解。裂解后的細(xì)胞液與等量的SDS樣品緩沖液混合后保存，調(diào)整細(xì)胞濃度至2000個(gè)

5、/μl。同時(shí)制備HeLa細(xì)胞作為對(duì)照。細(xì)胞裂解液使用前于-80℃保存。 (二)蛋白質(zhì)免疫印記雜交裂解細(xì)胞液煮沸后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)后與血清孵育。同一份血清同時(shí)與HPAEC和HeLa反應(yīng)，每個(gè)電泳槽20μl裂解細(xì)胞液。NC膜用含5％脫脂奶粉的PBS封閉，于4℃過夜。用PBS-NP40(含有0.05％NP40的PBS)洗滌3次后，NC膜同患者血清(以PBS做1：100稀釋)于室溫反應(yīng)3h。

6、PBS-NP40洗滌3次后，NC膜于羊抗人IgG(H+L)的PBS(1：7500，Promega， Corp．USA．)中孵育2h。再次用PBS-NP40洗滌3次，NC膜上結(jié)合的IgG蛋白經(jīng)BCIP/NBT顯影觀察。以上所有的孵育反應(yīng)過程均在封閉的聚乙烯透明袋中進(jìn)行。 三、抗-HPAEC特異性抗體洗脫印記雜交 為分析抗HPAEC抗體同其它自身抗體的結(jié)構(gòu)相關(guān)性，NC膜上同HPAEC抗原結(jié)合的自身抗體，用ImmtmoPure

7、<○R>IgG洗脫緩沖液(PIERCE，USA)洗脫。含有目的抗體的NC膜，置于3ml洗脫緩沖液中，震蕩5min后，收集洗脫液。另取3ml洗脫緩沖液，重復(fù)上述過程一次。于最后收集的6ml洗脫液中加入800μgl1MTris-HCl(PH 7.5)，調(diào)整pH值至7.0。血清IgG抗體洗脫液，進(jìn)一步同HPAEC和HeLa細(xì)胞抗原雜交反應(yīng)。 四、流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原 (一)細(xì)胞的收集用0.01％EDTA/PBS(含鈣

8、離子)10-20ml沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶，適當(dāng)用力拍打，使附壁生長(zhǎng)的HPAEC從內(nèi)壁解離。重復(fù)兩次，收集所有細(xì)胞懸液，至計(jì)數(shù)后平均每個(gè)樣品細(xì)胞數(shù)2～4×10<'4>個(gè)。HeLa細(xì)胞則直接取出同樣數(shù)量細(xì)胞的細(xì)胞懸液。用2％FCS/PBS液洗滌兩次后，離心，各留取約2ml的細(xì)胞懸液。 (二)細(xì)胞樣品熒光抗體染色每一個(gè)染色管中加入200μl細(xì)胞懸液后，加入2μl血清?；靹蚝?℃避光反應(yīng)1h。每管加入2％FCS/PBS溶液2ml，低溫離心(2

9、000rpm，5min)，洗滌兩次，棄上清。待檢樣品用1μl anti-Human IgG-FITC標(biāo)記染色，另設(shè)陰性對(duì)照管及陽(yáng)性對(duì)照管，陰性對(duì)照不加熒光抗體，陽(yáng)性對(duì)照加入anti-Human CD54：IgG-Biotin及Avidin-FITC各1μl，混勻后4℃避光反應(yīng)1h。用2％FCS/PBS洗滌兩次后，棄上清，靜置15min后，上機(jī)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、RNA-IPP篩選血清通過RNA-IPP分析法，選出抗U1R

10、NP抗體陽(yáng)性血清64例。其中SLE 31例，MCTD14例，SSc 3例，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)2例，干燥綜合征2例，PM、未分化CTD及皮膚型紅斑狼瘡患者各1例，另有9例患者的診斷尚不十分明確。64例中有4例合并PAH。 二、免疫雜交分析檢測(cè)抗HPAEC自身抗體通過RNA-IPP篩選的64例抗U1RNP抗體陽(yáng)性血清標(biāo)本中，其中有37例含有一種針對(duì)HPAEC31kDa抗原(HPA31)的抗

11、體。37例抗HPA31抗體陽(yáng)性標(biāo)本中有14例可同時(shí)檢測(cè)到與HPAEC 90kDa抗原(HPA90)反應(yīng)的自身抗體。兩種抗HPAEC抗體出現(xiàn)的陽(yáng)性率分別為57.8％(37/64)和21.9％(14/64)?？笻PA31抗體在HeLa細(xì)胞抗原檢出陽(yáng)性率僅為9.4％(6/64)，而在抗HPA31抗體陰性的血清和以HeLa細(xì)胞為抗原的反應(yīng)中，抗HPA90抗體均未檢出。提示HPA31和HPA90抗原主要在HPAEC上表達(dá)，抗U1RNP抗體陽(yáng)性患者

12、血清中存在特異性抗HPAEC的自身抗體?？笻PA31抗體和抗HPA90抗體，在4例合并PAH患者血清有3例出現(xiàn)陽(yáng)性，2例抗U1RNP抗體陰性合并PAH者及健康志愿者血清中兩種抗體均陰性。另外，與HeLa細(xì)胞抗原反應(yīng)時(shí)，37例抗HPA31抗體陽(yáng)性的標(biāo)本中有33例，同時(shí)檢測(cè)出抗32kDa及30kDa抗原的自身抗體(抗32/30kDa抗體)，出現(xiàn)的比率為89％。提示HeLa細(xì)胞的32/30kDa蛋白同HPAEC的31kDa蛋白、或者它們的抗體

13、之間可能存在某種關(guān)聯(lián)。 三、抗HPA31抗體同抗U1、U2、SmRNP抗體及抗U1RNP-B’/B、A、70K抗體相關(guān)性分析RNA-IPP分析發(fā)現(xiàn)，64份抗U1RNP抗體陽(yáng)性血清，其中37例抗HPA31抗體陽(yáng)性，而抗U1RNP抗體陰性血清則未檢出抗HPA31抗體?？筓1RNP抗HPA31抗體的檢出與抗U1RNP抗體存在顯著的相關(guān)性?？笻PA31抗體陽(yáng)性血清中，抗U2RNP抗體及抗Sm抗體陽(yáng)性者分別為11份和7份，僅占30％及19

14、％。同抗HPA31抗體陰性組相比，均無(wú)顯著性差異。 四、抗HPAEC抗體洗脫印記分析抗HPA31抗體和抗HPA90抗體洗脫液，分別同HPAEC及HeLa細(xì)胞抗原行免疫印記雜交分析。結(jié)果顯示，抗HPA31抗體不僅同HPA31抗原反應(yīng)，同時(shí)識(shí)別HPA90抗原。但抗HPA31抗體不能識(shí)別U1RNP-B’/B、A及70K抗原，也不能同HeLa細(xì)胞上的任何抗原(包括30kDa及32kDa抗原)反應(yīng)。表明抗HPA31抗體同抗U1RNP-B’

15、/B、A和70K抗體以及同HeLa細(xì)胞30kDa及32kDa抗原的抗體無(wú)交叉反應(yīng)；抗HPA90抗體經(jīng)洗脫雜交反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，它可以和HPA31抗原以及HeLa細(xì)胞的50kDa， 32kDa和30kDa抗原發(fā)生反應(yīng)。以上結(jié)果說明抗HPA90抗體與抗HPA31抗體之間有交叉反應(yīng)性，并且提示HPA90與HeLa細(xì)胞50kDa， 32kDa和30kDa的抗原及相應(yīng)抗體之間存在關(guān)聯(lián)。 五、流式細(xì)胞分析檢測(cè)HPAEC表面抗原6份抗HPAEC陽(yáng)性

16、血清中有4份可以檢測(cè)到與HPAEC表面抗原反應(yīng)的抗體，而所有抗HPAEC陰性的血清中均未檢出。HeLa細(xì)胞表面與血清抗體結(jié)合的表面抗原均為陰性。提示與HPAEC特異性抗體反應(yīng)的抗原存在于細(xì)胞的表面，且主要在HPAEC上表達(dá)。 研究結(jié)論： 1、CTD患者血清中存在與HPAEC反應(yīng)的特異性IgG抗體，該抗體可識(shí)別HPAEC分子量為31kDa(HPA31)和90kDa(HPA90)的抗原。 2、抗HPA31抗體的檢出同

17、抗U1RNP抗體、抗U1RNP-B’/B抗體、抗U1RNP-A抗體有關(guān)聯(lián)，而與抗U1RNP-70K、抗U2RNP抗體、抗SmRNP抗體不相關(guān)。 3、抗HPA31抗體同抗HPA90抗體具有交叉反應(yīng)性，但兩者均不能識(shí)別U1RNP-B’/B、U1RNP-A及U1RNP-70K抗原?？笻PAEC抗體同抗U1RNP抗體結(jié)構(gòu)上無(wú)關(guān)聯(lián)。 4、HPA31抗原和HPA90抗原位于HPAEC的表面。 5、抗HPAEC抗體可通過與細(xì)胞