1、本文研究調(diào)控雞雄性生殖細胞的發(fā)生及分化機制，本研究對雞雄性ESCs，雄性PGCs以及SSCs的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄本差異基因進行了進一步的深入分析，篩選出了另一條對雄性生殖細胞形成過程起到重要調(diào)控作用的JAK-STAT(Janus kinase-signal transducerand activator of transcription)信號通路，并對該通路進行了體內(nèi)和體外的功能驗證;為了解決體外雄性生殖細胞分化效率較低的問題，本研究還

2、通過懸滴培養(yǎng)的方法，摸索雞ESCs形成類胚體的最佳條件;最后對不同的誘導(dǎo)體系進行了比較，以期為ESCs向雄性生殖細胞定向分化篩選出最佳誘導(dǎo)體系，為生殖細胞形成機制的闡明提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果如下:
　　(1)本研究通過對雞ESCs-male、PGCs-male和SSCs轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq檢測結(jié)果，從整體轉(zhuǎn)錄組水平對雄性生殖細胞生成過程中基因的表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制，進行系統(tǒng)、全面地分析。通過篩選差異表達基因，探討雞雄

3、性生殖細胞形成過程中三種細胞的關(guān)鍵基因的表達變化，并利用GO分析和pathway分析對差異表達基因進行聚類分析，篩選參與調(diào)控雞雄性生殖細胞形成過程中的關(guān)鍵信號通路。通過上述過程，本研究篩選出差異信號通路——JAK-STAT信號通路可能參與雞雄性生殖細胞形成過程。為了驗證RNA-Seq分析結(jié)果的可靠性，通過qRT-PCR和Microarray測序技術(shù)雙向檢驗了RNA-Seq測序結(jié)果的可靠性。結(jié)果顯示，所選基因的表達趨勢在qRT-PCR，M

4、icroarray和RNA-Seq三種結(jié)果中雖然表達差異倍數(shù)上有所不同，但是變化趨勢一致，驗證了RNA-Seq測序結(jié)果的可靠性，說明基于RNA-Seq結(jié)果而篩選的參與雞雄性生殖細胞分化過程的關(guān)鍵基因和信號通路具有可靠性和準確性。
　　(2)將雞ESCs培養(yǎng)傳代至第三代，采用1×104個/mL，3×104個/mL和6×104個/mL三個細胞濃度，使用懸滴培養(yǎng)后觀察類胚體的形成效率。并通過形態(tài)學，qRT-PCR，免疫細胞化學，核型分析

5、以及類胚體體外自分化等方法對形成的類胚體進行檢測。結(jié)果表明，在3×104個/mL的細胞濃度下，通過不含干細胞維持因子的培養(yǎng)液懸滴培養(yǎng)48h，類胚體形成數(shù)量最多，單個視野下可觀察到約267個類胚體，表明3×104個/mL為雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的最適濃度。能一次性獲得相對較多的EB，且大小基本一致，可重復(fù)性高。對形成的類胚體進行qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，其持續(xù)表達干性基因Nanog，Sox2，Oct4和C-kit，且免疫細胞化學檢

6、測Nanog和SSEA-1呈陽性。另外，對懸滴培養(yǎng)形成的類胚體進行核型分析，發(fā)現(xiàn)類胚體在形成過程中具有正常的核型。試驗結(jié)果表明，本研究中采用懸滴培養(yǎng)法形成類胚體能夠分化成3個胚層，可用于體外定向誘導(dǎo)過程。該研究建立了雞ESCs體外懸滴培養(yǎng)形成類胚體的培養(yǎng)體系，為后期信號通路的體外驗證提供試驗基礎(chǔ)。
　　(3)取培養(yǎng)至2代的雄性ESCs，利用反式維甲酸(ATRA，All Trans Retinoic Acid)，維甲酸類似物(Am8

7、0，Tamibarotene)以及雌二醇(E2，Tamibarotene)，探索體外誘導(dǎo)雞ESCs向雄性生殖細胞(MGCs)分化的效果。結(jié)果表明:ATRA誘導(dǎo)組，2-4d類胚體逐漸形成并增加，6-8d類胚體細胞發(fā)生解體，12d觀察到生殖樣細胞，成葡萄串狀聚團生長;生殖細胞相關(guān)基因Cvh，C-kit，integrinα6和integrinβ1的最高表達量可分別達到1.03，0.52，0.86和1.50。Am80誘導(dǎo)組，4-6d類胚體出現(xiàn)并

8、逐漸增大，8-10d類胚體解體變?yōu)樾〉膱A形細胞，12d觀察到生殖樣細胞;生殖細胞相關(guān)基因Cvh, C-kit，integrinα6和integrinβ1的最高表達量可分別達到0.85，0.40，1.01和0.98。E2誘導(dǎo)組，2-4d類胚體出現(xiàn)，6-8d持續(xù)形成并逐漸增大，10d部分類胚體開始解體，少量生殖樣細胞開始形成，12d觀察到生殖樣細胞數(shù)目增加，并呈現(xiàn)出聚團生長的趨勢;生殖細胞相關(guān)基因Cvh，C-kit，integrinα6和i

9、ntegrinβ1的最高表達量可分別達到0.48，0.50，1.10和1.20。自分化組生殖細胞相關(guān)基因Cvh, C-kit，integrinα6和integrinβ1的表達無明顯變化。結(jié)果證明，反式維甲酸(ATRA)，維甲酸類似物(Am80)以及雌二醇(E2)可以作為雞ESCs體外定向誘導(dǎo)分化為雄性生殖細胞的候選誘導(dǎo)劑。該研究為進一步優(yōu)化雞ESCs向雄性生殖細胞分化的誘導(dǎo)體系，為進一步深入研究JAK-STAT信號通路的調(diào)控機理提供理論

10、和試驗基礎(chǔ)。
　　(4)取新鮮的受精雞胚，利用JAK-STAT信號通路抑制劑CucurbitacinⅠ和激動劑IL6進行雞胚注射，并設(shè)立正常孵化組和對照組，正常條件孵化。分別收集雞胚孵化4.5 d的生殖嵴樣本及19 d睪丸樣本，qRT-PCR，Western blot，細胞流式分選，PAS染色，免疫組化等方法檢測雞雄性生殖細胞體內(nèi)動態(tài)變化，以揭示JAK-STAT信號通路對生殖細胞的分化作用。結(jié)果表明，JAK-STAT信號通路抑制后

11、孵化4.5d的雞胚生殖嵴中，抑制組生殖細胞標記基因Cvh的表達量(12.34)和C-kit的表達量(14.83)與對照組相比均顯著下調(diào);孵化19d睪丸中，抑制組integrinα6的表達量(30.03)和integrinβ1的表達量(36.48)與對照組相比顯著下降。與此同時，流式分選檢測的生殖細胞Cvh，C-kit，integrinα6和integrinβ1標記率分別下降至7.3％，12.8％，5.6％和5.3％。PAS染色和免疫組化

12、染色結(jié)果表明，JAK-STAT信號通路被抑制后，4.5d雞胚的性腺發(fā)育遲緩，性腺內(nèi)PGCs數(shù)量減少。相反，JAK-STAT信號通路被激動后，生殖細胞標記基因Cvh和C-kit基因的表達量分別提高至15.82和16.13，流式分選檢測的生殖細胞Cvh和C-kit陽性細胞率分別上升至11.3％和14.1％。PAS染色和免疫組化染色結(jié)果表明，JAK-STAT信號通路被激動后，4.5d雞胚性腺內(nèi)PGCs數(shù)量顯著提高。該結(jié)果驗證了JAK-STAT

13、信號通路在雞雄性生殖細胞體內(nèi)分化過程中起到關(guān)鍵作用。JAK-STAT信號通路參與雞雄性生殖細胞體內(nèi)分化過程，尤其是對雞雄性生殖細胞的早期形成具有重要調(diào)控作用。
　　(5)取培養(yǎng)至2代的雄性ESCs，在RA誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，加入抑制劑CucurbitacinⅠ和激動劑IL6，對JAK-STAT信號通路在雞ESCs體外定向分化為雄性生殖細胞過程的作用進行了研究。qRT-PCR，細胞間接免疫熒光等方法檢測誘導(dǎo)過程中關(guān)鍵基因和蛋白的動態(tài)表達變

14、化，以揭示JAK-STAT信號通路對生殖細胞的體外分化過程的作用。結(jié)果表明，在RA能夠成功激活生殖細胞特異表達基因C-kit，Cvh，integrinα6和intergrinβ1的基礎(chǔ)上，加入JAK-STAT信號通路抑制劑后，C-kit最高表達量僅為0.32，Cvh的最高表達量僅達到0.41;細胞間接免疫熒光檢測同樣顯示C-kit和Cvh陽性細胞數(shù)目少于RA誘導(dǎo)組，RA誘導(dǎo)組相比C-kit和Cvh激活受到了抑制;并且在誘導(dǎo)期間，抑制組i

15、ntegrinα6和intergrinβ1的表達水平均低于同一時間RA誘導(dǎo)下的表達水平，RA的誘導(dǎo)效果受到了抑制作用。相反，加入JAK-STAT信號通路激動劑后，誘導(dǎo)6d就出現(xiàn)了生殖細胞特異基因C-kit和Cvh的表達高峰，比RA誘導(dǎo)激活時間提前;并且integrinα6和intergrinβ1的表達量分別能提高至1.60和1.65，細胞間接免疫熒光檢測同樣顯示integrinα6和intergrinβ1陽性細胞數(shù)目少于RA誘導(dǎo)組，JA