1、目的： 分別構(gòu)建HBV截短型中蛋白(MHBst)真核表達(dá)載體與帶有端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子和熒光素酶的報(bào)告基因質(zhì)粒，利用體外共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)入端粒酶表型不同、處于不同分化階段的多種細(xì)胞中，通過檢測(cè)熒光素酶活性，探討MHBst對(duì)hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控作用，為揭示HBV相關(guān)性疾病的發(fā)生機(jī)制提供新思路。 方法： 1.乙肝病毒截短型中蛋白在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其反式激活作用研究 設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增兩條長度

2、不同的HBV截短型中蛋白基因片段，分別定向克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcS2與pcTS。重組子經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定。將重組子與報(bào)告質(zhì)粒pGL3-control共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2，檢測(cè)熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，以驗(yàn)證所構(gòu)建的HBV截短型中蛋白表達(dá)載體在體外的反式激活作用。為進(jìn)一步研究HBV截短型中蛋白及編碼基因片段對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，將重組質(zhì)粒pcS2和pcTS分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2，經(jīng)G418篩選，獲得陽性細(xì)胞，

3、通過生長曲線與集落形成試驗(yàn)研究MHBst對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響。 2.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒 分別用雙酶切和PCR方法從pCR-TRTP載體上獲得全長hTERT啟動(dòng)子基因序列TRTP與5'端缺失hTERT啟動(dòng)子基因序列Del445(包含有HBV同源序列)，分別克隆到pGL3-basic多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建真核表達(dá)載體pGL3-TRTP，pGL3-del445。重組子經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定。將重組子pGL3

4、-TRTP/pGL3-del445分別與pRL-tk共轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系HELF、LO2、Bel7402，通過檢測(cè)熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，評(píng)估報(bào)告基因質(zhì)粒中端粒酶啟動(dòng)子活性。 3.MHBst對(duì)hTERT啟動(dòng)子的調(diào)控作用 將MHBst真核表達(dá)質(zhì)粒pcS2與hTERT全長啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-TRTP共轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系HepG2、LO2、Bel7402，檢測(cè)熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度。為排除基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中外源過量表達(dá)的MHBst蛋白對(duì)hTE

5、RT的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)硫代反義寡核苷酸反義封閉S2區(qū)，RT-PCR選擇合適濃度的反義寡核苷酸。將反義寡核苷酸、pcS2和pGL3-TRTP共轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞，同時(shí)設(shè)隨機(jī)序列為對(duì)照，研究MHBst對(duì)hTERT啟動(dòng)子特異性調(diào)控作用。 結(jié)果： 1.MHBst真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及對(duì)肝癌生物學(xué)活性的影響 測(cè)序結(jié)果表明成功構(gòu)建了兩種HBV截短型中蛋白表達(dá)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染證明所構(gòu)建的兩種截短中蛋白表達(dá)載體pcS2/pcTS均具有反式激活

6、作用，可反式激活pGL3-control的SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，熒光表達(dá)強(qiáng)度分別高出空質(zhì)粒對(duì)照組2.092倍和1.534倍，且pcS2反式激活作用強(qiáng)于pcTS(p＜0.01)。經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定表達(dá)HBV截短中蛋白的肝癌細(xì)胞系，分別命名為HepG2-pcS2與HepG2-pcTS，生長曲線顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HBV截短中蛋白的肝癌細(xì)胞生長增快，第六天細(xì)胞數(shù)分別高于空質(zhì)粒細(xì)胞HepG2-pcDNA3細(xì)胞數(shù)1.621與1.548倍。且其集落形成

7、能力明顯增高，克隆數(shù)分別高于空質(zhì)粒HepG2-pcDNA3克隆數(shù)1.266倍與1.286倍。 2.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子真核表達(dá)載體的構(gòu)建 經(jīng)測(cè)序證明成功構(gòu)建了全長hTERT啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-TRTP與包含HBV同源序列的缺失hTERT啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-del445。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重組子在端粒酶陽性細(xì)胞系LO2、Bel7402中熒光素酶高效表達(dá)，與空載體pGL3-basic相比，pGL3-del44

8、5在LO2與Bel7402細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度分別高出15.381，13.481倍，pGL3-TRTP分別高出15.351，23.726倍，而在端粒酶陰性細(xì)胞HELF中熒光素酶不表達(dá)。 3.MHBst對(duì)hTERT啟動(dòng)子的反式激活作用 兩質(zhì)粒pcS2與pGL3-TRTP共轉(zhuǎn)染端粒酶表型不同的三種細(xì)胞系，檢測(cè)雙熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果顯示在三種細(xì)胞系LO2、HepG2、Bel7402中，重組子pcS2作用下的pGL3-TRT

9、P熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度比空質(zhì)粒pcDNA3作用下的pGL3-TRTP熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度升高(p＜0.05)，分別高出28.16％，17.55％與19.41％。這說明在不同細(xì)胞系中，HBV截短中蛋白對(duì)hTERT啟動(dòng)子有反式激活作用。反義技術(shù)證實(shí)：在三種細(xì)胞系LO2、HepG2、Bel7402中，反義寡核苷酸作用組的熒光素酶表達(dá)強(qiáng)度低于隨機(jī)序列組(p＜0.05)，分別低18.81％，21.21％，22.15％。隨機(jī)序列組與未加隨機(jī)序列組沒有明顯區(qū)

10、別。這說明HBV截短中蛋白特異反式激活hTERT啟動(dòng)子。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了HBV截短中蛋白表達(dá)載體pcS2與pcTS，通過共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明兩載體都具有反式激活作用，且pcS2反式激活作用高于pcTS。 2.篩選出穩(wěn)定表達(dá)MHBst的肝癌細(xì)胞系，生長曲線與集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MHBst穩(wěn)定表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和其集落形成能力。 3.成功構(gòu)建了帶有端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子的報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明該啟動(dòng)子在