1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 瘧疾是瘧原蟲(chóng)通過(guò)媒介昆蟲(chóng)蚊傳播的人類最為嚴(yán)重的寄生原蟲(chóng)感染性疾病。2009年WHO瘧疾報(bào)告顯示,瘧疾流行于非洲、亞洲和拉丁美洲等的109個(gè)國(guó)家,全球約33億人口受到瘧疾威脅。每年有大約2.5億瘧疾病例發(fā)生,近百萬(wàn)人死于瘧疾感染。瘧疾已成為全球最嚴(yán)重的三大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。因此,有效瘧疾疫苗和抗瘧新藥的研制開(kāi)發(fā)已經(jīng)成為當(dāng)今世界迫切需要解決的重點(diǎn)課題,而瘧原蟲(chóng)感染宿主機(jī)體應(yīng)答的免疫學(xué)、分子生物學(xué)等綜合基礎(chǔ)研究是其重

2、要前提。
　　 在體內(nèi)建立適時(shí)、適度的保護(hù)性免疫應(yīng)答有賴于免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的精確調(diào)控。大量研究表明,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory Tcell,Treg)在宿主免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮舉足輕重的作用。在鼠瘧或流行區(qū)個(gè)體均已經(jīng)發(fā)現(xiàn)瘧疾感染會(huì)引起Treg數(shù)量變化。瘧疾流行區(qū)研究發(fā)現(xiàn),流行區(qū)個(gè)體對(duì)瘧疾感染的高抵抗性源于Treg功能性缺失。惡性瘧患者體內(nèi)Treg的活化與瘧原蟲(chóng)高水平增殖密切相關(guān)。同時(shí),間日瘧原蟲(chóng)感染中Treg數(shù)量增高與原蟲(chóng)負(fù)荷

3、增加有關(guān)。但同時(shí)有研究證實(shí)Treg不能對(duì)瘧疾急性期感染發(fā)揮調(diào)控作用。Hiseada等多個(gè)研究小組證實(shí)Treg能夠輔助原蟲(chóng)逃避宿主免疫監(jiān)視,Treg可能是宿主對(duì)原蟲(chóng)發(fā)生免疫耐受的主要原因。但近期有研究顯示,消除Treg將導(dǎo)致宿主貧血、原蟲(chóng)負(fù)荷增加和病理性炎癥應(yīng)答等不良癥狀出現(xiàn)。因此,Treg在瘧疾感染中的作用尚待深入研究。
　　 我們前期的研究顯示,致死型約氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumyoelii17XL,P.y17XL)感染中

4、,BALB/c小鼠的易感性與體內(nèi)Treg的活化密切相關(guān)。DBA/2小d鼠在P.y17XL和致死型夏氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium chabadudi chabadui AS,.P.c chabadui AS)感染中呈現(xiàn)截然相反的感染結(jié)局。為深入探討Treg在瘧疾感染中的作用地位,本研究動(dòng)態(tài)觀察了P.c chabadui AS感染DBA/2小鼠體內(nèi)Treg活化特點(diǎn),系統(tǒng)研究了P.cchabaudi AS感染中Treg對(duì)Th免疫應(yīng)答的調(diào)控效

5、應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制,以期進(jìn)一步明確Treg在瘧疾感染過(guò)程中的作用地位。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其模型構(gòu)建
　　 6-8周齡、雌性DBA/2小鼠,經(jīng)腹腔分別感染1×106 P.c chabaudi AS寄生的紅細(xì)胞(pRBC),構(gòu)建不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。
　　 2、體內(nèi)CD25+T細(xì)胞消除
　　 DBA/小鼠于感染前d1、感染后d1和d3,經(jīng)腹腔給予抗CD25mAb(1mg/鼠/次),抗C

6、D25mAb來(lái)自經(jīng)Hi-Trap Protein G柱純化的7D4雜交瘤細(xì)胞株接種的裸鼠腹水。與實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)同一時(shí)間點(diǎn),對(duì)照組DBA/2小鼠經(jīng)腹腔給予同體積的1×PBS。
　　 3、脾細(xì)胞熒光抗體染色
　　 無(wú)菌取出感染前(d0)和感染后d3、5、8、10小鼠脾臟,常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液。取0.1ml脾細(xì)胞懸液,預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體1μg封閉30min。設(shè)陰性對(duì)照管及對(duì)應(yīng)單標(biāo)管。為染色CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞

7、,每份樣品同時(shí)用抗-CD4-FITCmAb和抗-CD25-PE mAb進(jìn)行細(xì)胞表面雙色標(biāo)記,4℃孵育30min。每管加0.25ml固定透膜劑,4℃孵育1h。再加入抗-Foxp3-APC mAb進(jìn)行胞內(nèi)染色,4℃孵育30min。用0.5ml FBS/PBS重懸細(xì)胞,待流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。為染色胞內(nèi)Ig表達(dá)水平,每份樣品同時(shí)用抗-B220-PerCP和抗-CD138-PE mAb進(jìn)行細(xì)胞表面雙色標(biāo)記,4℃孵育30min。每管加0.25mlB

8、D固定透膜劑,4℃孵育1h。再加入抗-IgG1-FITC或抗-IgG2a-FITC mAb進(jìn)行胞內(nèi)染色,4℃孵育30min。用0.5ml FBS/PBS重懸細(xì)胞,待流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　 4、IFN-γ和TNF-α定量檢測(cè)
　　 采用ELISA方法,分別檢測(cè)經(jīng)培養(yǎng)48h脾細(xì)胞上清IFN-γ和TNF-α分泌水平。酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處OD值。結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1LS

9、軟件分析,計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 5、NO水平檢測(cè)
　　 Griess方法檢測(cè)經(jīng)培養(yǎng)48h脾細(xì)胞上清中NO2-水平。計(jì)算其含量(μM)。
　　 6、CD4+T細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)
　　 常規(guī)收集脾細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞濃度1×105個(gè)/管。設(shè)陰性對(duì)照管和單標(biāo)管。每管加抗-CD4-FITC mAb進(jìn)行細(xì)胞表面染色,4℃孵育30min。再加入5ul7-AAD和5ulPE-Annexing-V原液,輕柔震動(dòng),

10、37℃避光孵育15分鐘。每管加0.5ml FBS/PBS,輕柔震動(dòng),待流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件,Student's test比較分析組內(nèi)和組間均值的差異。P小于或等于0.05為差異顯著。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、P.c chabaudi AS感染小鼠原蟲(chóng)血癥水平和生存率
　　 DBA/2小鼠腹腔接種1×106 P.c chabaudi

11、 AS寄生的紅細(xì)胞(pRBC)后,于感染后d5在外周血中可見(jiàn)瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞,隨后紅細(xì)胞感染率迅速上升。在感染后d5-7期間,紅細(xì)胞感染率從1％升至28％。在感染后d8-9,紅細(xì)胞感染率達(dá)到峰值(40.3％)。DBA/2小鼠于感染峰值后全部死亡。瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞在Treg消除鼠外周血中延遲出現(xiàn)(d6-7),紅細(xì)胞感染率在達(dá)峰值前(d5-7)明顯低于對(duì)照組。并且,原蟲(chóng)血癥達(dá)峰值(37.5％)時(shí)間延遲至感染后d10。隨后,紅細(xì)胞感染率陡

12、然下降,在感染后d10-15從35％降至3％,在感染后d20瘧原蟲(chóng)被徹底清除,小鼠生存期明顯延長(zhǎng)。
　　 2、P.c chabaudi AS感染小鼠CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞數(shù)量
　　 與na(I)ve小鼠相比,在感染后d5-10,DBA/2小鼠感染P.c chabaudi AS后Foxp3表達(dá)水平明顯增加。為此,我們以na(I)ve小鼠表達(dá)Foxp3熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn),Foxp3表達(dá)熒光強(qiáng)度高于103以上者視為Fo

13、xp3hi。與na(I)ve小鼠相比,在感染后d5-10,DBA/2小鼠CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞總數(shù)增加了2-5倍,CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞總數(shù)增加了約6-30倍。CD4+CD25+Foxp3hi占CD4+T細(xì)胞百分含量比從初始0.1％增至峰值2％。在感染后d5-10,CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞比CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的增殖幅度明顯。
　　 Treg消除鼠感染P.c chabaudi

14、AS后CD25表達(dá)一過(guò)性短暫下調(diào),隨后出現(xiàn)明顯回升。在感染后d8,Treg消除組脾臟CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞百分含量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。相比,Treg消除組Foxp3表達(dá)水平明顯降低且維持較長(zhǎng)時(shí)間。與對(duì)照組相比,Treg消除組從感染后d3,Foxp3表達(dá)有降低趨勢(shì)。在感染后d5-8明顯下降,于感染后d10,Foxp3表達(dá)回升至對(duì)照組水平。在感染后d3,Treg消除組脾臟CD4+CD25+Foxphi細(xì)胞總數(shù)是對(duì)照組的30％,隨

15、著對(duì)照組CD4+CD25+Foxphi細(xì)胞總數(shù)的增加,Treg消除組CD4+CD25+Foxphi細(xì)胞所占其比例進(jìn)一步降低。在對(duì)照組CD4+CD25+Foxphi細(xì)胞總數(shù)達(dá)峰值時(shí),Treg消除組CD4+CD25+Foxphi細(xì)胞總數(shù)是對(duì)照組的15％。
　　 3、P.c chabaudi AS感染小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清前炎癥因子水平
　　 為明確Treg對(duì)Th1型免疫應(yīng)答的影響,我們檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中前炎癥細(xì)胞因子水平。與n

16、a(I)ve小鼠相比,DBA/2小鼠感染p.c chabaudi AS后d3-5,前炎癥細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α明顯增加,且巨噬細(xì)胞活化特征性標(biāo)志NO水平亦明顯增加。與對(duì)照組相比,Treg消除組于感染后IFN-γ、TNF-α和NO的分泌水平進(jìn)一步增強(qiáng)。
　　 4、P.c chabaudi AS感染小鼠脾臟漿細(xì)胞數(shù)量
　　 為確定Treg是否調(diào)控由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答,我們檢測(cè)了B220lowCD138+漿細(xì)

17、胞、胞內(nèi)合成IgG1(iIgG1+)和胞內(nèi)合成IgG2a(ilgG2a+)的細(xì)胞數(shù)量。與對(duì)照組相比,Treg消除組脾臟B220lowCD138+總漿細(xì)胞數(shù)量在感染后d8出現(xiàn)一過(guò)性降低,在感染后d10恢復(fù)至對(duì)照組水平。在感染后d10,Treg消除組脾臟iIgG1+和iIgG2a+細(xì)胞總數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
　　 5、P.c chabaudi AS感染小鼠脾臟IL-12+細(xì)胞數(shù)量
　　 與na(I)ve小鼠相比,在感染

18、后d3-5,DBA/2小鼠胞內(nèi)合成IL-12(IL-12+)的細(xì)胞總數(shù)增加。與對(duì)照組相比,在感染后d3-5,Treg消除組IL-12+細(xì)胞總數(shù)增加更為明顯。
　　 6、P.c chabaudi AS感染小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞凋亡水平
　　 與對(duì)照組相比,在感染后d3-5,Treg消除組的CD4+T細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯降低。
　　 7、P.c chabaudi AS感染小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10和TGF-β水平

19、>　　 與對(duì)照組相比,在感染后d5-8,Treg消除組脾細(xì)胞上清IL-10水平明顯升高。而TGF-β水平變化趨勢(shì)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、P.c chabaudi AS感染導(dǎo)致DBA/2小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)增高。擴(kuò)增的CD4+CD25+Foxp3hi細(xì)胞與原蟲(chóng)負(fù)荷密切相關(guān),明顯影響著瘧疾感染的進(jìn)程和最終結(jié)局。
　　 2、P.c chabaudi AS感染早期,CD4+CD