1、腫瘤是目前威脅人類生命的最嚴重的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計，90％以上的腫瘤患者是因為耐藥性而導致臨床化療失敗。導致腫瘤耐藥性的原因是多方面的，其中由于腫瘤的快速增長，腫瘤微環(huán)境表現(xiàn)出的一些異?，F(xiàn)象，如高壓、缺氧、酸性環(huán)境以及新生血管生成現(xiàn)象進一步導致了腫瘤的耐藥性。腫瘤間質中的高壓現(xiàn)象直接導致抗癌藥物難以進入腫瘤組織；腫瘤缺氧環(huán)境會激活低氧誘導因子（HIF-1）生成而導致腫瘤細胞的耐受能力增加；而新生血管生成會促進血栓形成并導致血氧供給不通暢。

2、這些特定的腫瘤微環(huán)境為化療藥物到達腫瘤組織設置了巨大的障礙。因此，如何增加化療藥物在耐藥腫瘤內的有效濃度是治療腫瘤的關鍵。
　　本課題設計并合成多功能逐級pH響應釋藥的納米載藥體系，該體系具有顯著的長循環(huán)功能。它可以先釋放抗腫瘤血管藥物改善腫瘤微環(huán)境，使腫瘤血管暫時“正?；保瑸槟[瘤血管給藥提供有利條件，然后增加抗腫瘤藥物在耐藥腫瘤細胞內的有效藥物濃度，從而協(xié)同發(fā)揮作用抗多藥耐藥腫瘤。本課題采用抗腫瘤新生血管藥物康普瑞汀A4（CA

3、4）和聚天冬氨酸-肼-阿霉素大分子前藥（Pasp-DOX）作為藥物模型，將具有生物相容性的聚乙二醇-組氨酸共聚物（簡稱PEG-Phis）作為藥物載體來制備納米載藥膠束。本課題主要對聚合物的合成及結構確證、納米膠束的制備和制劑學性質、細胞毒性、細胞內吞及其內吞機制、體內藥代動力學和藥效學行為進行研究。
　　（1）以聚組氨酸為疏水基團，聚乙二醇為親水基團，通過開環(huán)聚合反應合成不同長度疏水鏈的聚乙二醇-組氨酸共聚物(簡稱PEG-Phis

4、20、PEG-Phis40、PEG-Phis60、PEG-Phis80)，采用1H-NMR確證目標化合物的結構，并采用酸堿滴定法選取在pH5.6-7.1的范圍具有顯著緩沖能力的PEG-Phis40和PEG-Phis60共聚物作為納米藥物載體，同時采用尼羅紅熒光探針法測定選取載體的臨界膠束濃度；抗腫瘤藥物阿霉素（DOX）以pH響應斷裂的腙鍵（肼鍵）鍵合到聚天冬氨酸上合成大分子前藥聚天冬氨酸-肼-阿霉素（Pasp-DOX），并采用1H-NM

5、R確證了目標化合物的結構。
　?。?）以抗血管藥物康普瑞?。–A4）和聚天冬氨酸-肼-阿霉素（Pasp-DOX）作為藥物模型，以聚乙二醇-組氨酸共聚物 PEG-Phis40和PEG-Phis60共聚物為納米藥物載體，采用一步納米沉淀法制備膠束。以粒徑、包封率以及血清穩(wěn)定性作為指標，對納米膠束的制備工藝和處方條件進行優(yōu)化和篩選，并對納米膠束的制劑學性質進行考察。TEM和DLS結果均顯示，與PEG-Phis40共聚物形成的納米載藥體系

6、相比，PEG-Phis60共聚物形成的納米載藥體系分散性較好、粒徑均一、呈球形，對CA4和DOX的包封率分別為98.1%和96.1%，而且血清穩(wěn)定性較好，因此優(yōu)選PEG-Phis60制成的納米載藥體系進行后續(xù)研究。我們通過體外模擬腫瘤微環(huán)境以及腫瘤細胞內溶酶體的酸度值，把PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4納米載藥體系加入到不同pH值的酸性環(huán)境進行粒徑檢測。實驗結果顯示，隨著酸度增加，PEG-Phis60/Pasp-DOX/C

7、A4納米載藥體系的粒徑隨之變大，且TEM檢測顯示，pH5.0條件下，PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4納米載藥體系發(fā)生解膠束行為。采用透析法考察該納米載藥膠束中的CA4和DOX兩種藥物的體外釋放,結果表明，納米載藥膠束的CA4和DOX的釋放具有pH響應性。pH7.4條件下CA4在12h內累計釋放量為8.7%，而在pH6.6條件下CA4發(fā)生突釋，12h累計釋放64.1%。而DOX的釋放相對持久，當pH變化到5.8，DOX釋放加

8、速，14d累積釋放量達到57.1%。此種釋藥方式說明該納米載藥體系可以先釋藥改善腫瘤微環(huán)境，使腫瘤血管暫時“正常化”給腫瘤血管給藥提供有利條件，然后抗腫瘤大分子前藥進入腫瘤細胞后斷裂腙鍵釋放抗腫瘤藥物，以此達到協(xié)同抗腫瘤的目的。
　?。?）以人臍靜脈血管內皮細胞HUVEC作為模擬體內腫瘤血管微環(huán)境的細胞模型，以乳腺癌敏感株MCF-7細胞（乳腺癌耐藥株MCF-7/ADR細胞）作為體內腫瘤細胞的模型，通過檢測這兩種細胞的先后殺傷順序進

9、一步證明PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4納米載藥體系確實具有響應腫瘤微環(huán)境和腫瘤細胞溶酶體的pH而程序釋藥的性質。分別以MCF-7和MCF-7/ADR細胞為模型，以CA4、DOX、Pasp-DOX、DOX+CA4、Pasp-DOX+CA4、PEG-Phis60/DOX/CA4等制劑為參照，檢測PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4的細胞毒性、細胞內吞及內吞機制等。MTT實驗表明，對于MCF-7細胞，各制劑均具有一定

10、的抗腫瘤活性，但對于MCF-7/ADR細胞，各藥物制劑的抗腫瘤活性表現(xiàn)出很大差異。其中PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4制劑在MCF-7/ADR細胞中呈現(xiàn)顯著的細胞毒性，能顯著地克服腫瘤的多藥耐藥性。采用流式細胞儀和共聚焦顯微鏡技術評價了納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4在MCF-7以及MCF-7/ADR細胞中內吞情況，結果表明納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能顯著提高藥物在

11、耐藥腫瘤細胞中的內吞，內吞抑制實驗表明兩種納米載藥體系具有不同的入胞方式。
　?。?）采用非房室模型模擬了各制劑在小鼠體內的藥動學性質。藥動學參數(shù)表明，納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能夠顯著提高阿霉素藥時曲線下面積，增加藥物在血漿中的循環(huán)時間，達到長循環(huán)的效果，從而能更好地使納米膠束通過EPR效應分布到腫瘤區(qū)域發(fā)揮療效。體內藥效學結果表明，納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4能顯著

12、抑制荷耐藥性乳腺癌移植瘤 BALB/C裸鼠的腫瘤增長，抑瘤率達到91.8%。體內臟器及腫瘤熒光成像實驗結果表明，納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4具有一定的腫瘤靶向性，而較少分布于正常組織。Masson三原色法和CD31免疫組化染色結果表明納米載藥膠束PEG-Phis60/Pasp-DOX/CA4具有抗腫瘤新生血管生成并顯著改善腫瘤微環(huán)境的作用，小鼠腫瘤切片的TUNEL和H&E染色實驗結果顯示納米載藥膠束PEG-