1、腫瘤細胞對抗腫瘤藥物產(chǎn)生多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)是導致腫瘤化療失敗的重要原因，也是化療介入腫瘤治療以來一直懸而未決的重要問題?？朔﨧DR的策略主要包括化療增敏劑如維拉帕米等的開發(fā)，腫瘤藥物進行結(jié)構(gòu)改造，生物技術相關的逆轉(zhuǎn)方法如基因治療等，這些策略均存在一定不足。藥物載體作為一種新型的MDR逆轉(zhuǎn)策略，既可提高化療藥物作用的敏感性，又可不增加化療藥物對正常組織的毒副作用，還可突破抗腫瘤藥物的劑量限制，可有

2、效克服上述克服MDR策略的不足而受到較大關注。 本論文分別制備了阿霉素(doxorubicin，DOX)脂質(zhì)體、阿霉素固體脂質(zhì)納米粒、阿霉素非離子型表面活性劑囊泡等三種納米制劑，并分別用非離子型表面活性劑、陽離子材料等修飾脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒，同時將脂質(zhì)體和維拉帕米聯(lián)合應用，對阿霉素的細胞積聚及其胞內(nèi)動力學特征，細胞攝取、外排機制和克服腫瘤細胞多藥耐藥作用的可能機制進行了探討，同時研究了PluronicP85修飾阿霉素脂質(zhì)體的

3、小鼠藥代藥動學和藥效學以及阿霉素非離子型表面活性劑囊泡的小鼠藥效學。 論文首先建立了耐藥細胞模型和分析測定方法。結(jié)果顯示K562/DOX細胞P-gp高表達，對阿霉素耐藥指數(shù)達107.50，而維拉帕米(Ver)可部分逆轉(zhuǎn)耐藥性。K562/DOX細胞可以作為以阿霉素為模型藥的納米制劑克服腫瘤細胞耐藥作用及機理研究的細胞模型。以熒光分光光度計法測定DOX的濃度，DOX濃度在10～1000ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關系，相關系數(shù)為0.9

4、998；該方法日內(nèi)、日間精密度、回收率符合測定要求。并通過在測定過程添加0.1％十二烷基硫酸鈉孵育30min，有效地解決了阿霉素測定過程的熒光淬滅。 脂質(zhì)體可部分克服腫瘤多藥耐藥作用。首先采用硫酸銨梯度法制備了阿霉素脂質(zhì)體，藥物穩(wěn)定，滲漏少。K562/DOX細胞攝取結(jié)果顯示，阿霉素脂質(zhì)體(DOX-L)較同濃度的溶液(DOX-I)有更多被耐藥細胞攝取。而耐藥細胞外排阿霉素脂質(zhì)體較溶液緩慢，說明阿霉素脂質(zhì)體具有延緩藥物外排的作用。藥

5、物敏感試驗(MTT)檢測脂質(zhì)體的耐藥指數(shù)降低為3.30，說明阿霉素脂質(zhì)體可部分克服多藥耐藥。低溫和內(nèi)吞抑制劑(疊氮鈉、甘露醇和氯喹)均顯著降低K562/DOX細胞內(nèi)DOX的積聚，說明耐藥細胞攝取脂質(zhì)體是通過能量依賴性的內(nèi)吞方式。 為了進一步了解DOX的細胞動力學及其DOX在亞細胞器的分布，我們采用HPLC建立了細胞內(nèi)亞細胞器(細胞核)的含量測定方法。DOX-L和DOX-I在亞細胞器的分布結(jié)果顯示，與對照DOX-I相比，相同藥物量

6、的DOX-L與細胞孵育后，能顯著提高細胞核內(nèi)藥物量。而且脂質(zhì)體減慢消除速率，延長細胞內(nèi)藥物滯留時間，改變藥物在細胞內(nèi)的動力學特征和分布，提高了細胞核內(nèi)藥物量；說明阿霉素脂質(zhì)體有趨核分布的特點. 非離子型表面活性劑修飾脂質(zhì)體后，將對細胞攝取、外排行為和克服多藥耐藥產(chǎn)生影響。采用非離子型表面活性劑pluronic、Span、Tween和CremophorEL修飾脂質(zhì)體，包封率均達到90％以上，粒徑與阿霉素脂質(zhì)體相似。脂質(zhì)體滲漏結(jié)果顯

7、示，隨著非離子型表面活性劑HLB值的降低，滲漏加快。對于同系列的非離子型表面活性劑，2h時K562/DOX攝取藥物量隨非離子型表面活性劑的HLB值降低，攝取增加.但對不同系列的表面活性劑修飾的脂質(zhì)體，攝取量除與HLB值相關外，還可能與表面活性劑的性質(zhì)相關。MTT檢測結(jié)果顯示修飾后的細胞毒作用增加，隨HLB值降低，細胞毒作用增加，證實了非離子型表面活性劑修飾的阿霉素脂質(zhì)體可更有效克服多藥耐藥。 陽離子脂質(zhì)體可促進阿霉素趨核，但可能

8、降低耐藥細胞攝取藥物量。采用DC-Chol和CTAB制備了陽離子脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)進入細胞的藥物量較普通脂質(zhì)體有所下降，但細胞核的藥物量卻和脂質(zhì)體相當，細胞核百分比高于普通脂質(zhì)體。 維拉帕米核阿霉素脂質(zhì)體具有協(xié)同抗多藥耐藥作用。為了評價維拉帕米對阿霉素脂質(zhì)體攝取和外排行為的影響，試制了5種阿霉素制劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOX脂質(zhì)體與維拉帕米溶液混合液(DOX-L-FV)攝取速率快，2h攝取藥物量最大。而阿霉素和維拉帕米共同包被脂質(zhì)體(DOX-L

9、-LV)攝取速率相對慢，但達穩(wěn)態(tài)的時間延長，在4h攝取藥物量接近DOX-L-FV。由于DOX-L-LV可降低阿霉素和維拉帕米的心臟毒性，有望被開發(fā)為新劑型。細胞內(nèi)藥物外排結(jié)果顯示含維拉帕米組明顯減緩了外排速率。MTT檢測結(jié)果顯示：DOX-L-LV

10、nicP85)在小鼠的藥代動力學和藥效學。首先建立了小鼠血漿和組織樣品中DOX含量測定的HPLC方法。體內(nèi)藥動學研究結(jié)果顯示，DOX-L-PluronicP85可顯著延長DOX的體內(nèi)循環(huán)時間，提高血漿中藥物濃度，其消除半衰期為DOX-I的6.72倍，AUC為DOX-I的6.21倍。DOX-L-PluronicP85可增加DOX在腫瘤內(nèi)的分布，其AUC和峰濃度分別為DOX-I組的4.65和1.44倍。其各器官(包括心、腎、肝、脾、肺、腸)

11、的相對靶向效率均大于1，心、腎的相對靶向效率更是10倍以上，說明DOX-L-PluronicP85的小鼠心、腎毒性顯著低于DOX-I組(p<0.01)。DOX-L-PluronicP852mg/kg時其抑瘤率為30.83％，與同劑量的DOX-I抑瘤率相當(32.09％)；1mg/Kg和4mg/kg的DOX-L-PluronicP85的抑瘤率分別為28.53％和51.91％，顯示較好的劑量依賴性。DOX-I用藥后體重較對照組有所降低，而采

12、用DOX-L-PLURONICP85治療，體重較對照組增加，顯示了DOX-L-PluronicP85毒性低.腫瘤病理切片顯示，DOX-L-PLURONICP85對腫瘤細胞抑制作用顯著，對心肌毒性小。 固體脂質(zhì)納米粒(SLN)也可有效克服腫瘤多藥耐藥。通過陰離子聚合物絡合法有效地解決了水溶性細胞毒藥物阿霉素的固體脂質(zhì)納米粒包封率。與阿霉素溶液相比，固體脂質(zhì)納米?？梢燥@著提高細胞對藥物的攝取，說明固體脂質(zhì)納米粒具有克服腫瘤細胞耐藥性

13、的作用，而外排試驗說明固體脂質(zhì)納米?？梢匝泳徦幬锛毎麅?nèi)消除。我們分別采用PluronicF87、F88和P85三種不同Pluronic制備了DOX-SLN，其粒徑和包封率相似，但細胞攝取試驗顯示DOX-SLN-P85在各時間點進入細胞的量比DOX-SLN-F87和DOX-SLN-F88多。這可能由于Pluronic組成不同，導致耐藥細胞K562/DOX的細胞膜的流動性不同，從而影響SLN進入細胞的量。另外制備了CTAB修飾的DOX-SL

14、N，發(fā)現(xiàn)陽離子CTAB修飾的SLN具有細胞核靶向性。MTT實驗證實了DOX-SLN可部分克服多藥耐藥，低溫和內(nèi)吞抑制試驗說明細胞攝取DOX-SLN為通過能量依賴的內(nèi)吞途徑。 非離子型表面活性劑囊泡具有克服部分腫瘤多藥耐藥的作用。采用薄膜分散法制備了DOX非離子型表面活性劑囊泡(DOX-N)。DOX-N和耐藥細胞K562/DOX孵育后攝取進入細胞的量顯著高于阿霉素溶液，4h進入細胞的藥物為阿霉素溶液的1.4倍。內(nèi)吞抑制劑和低溫攝取

15、實驗顯示K562/DOX細胞攝取非離子型表面活性劑囊泡也主要通過內(nèi)吞途徑。MTT實驗提示DOX-N可部分克服多藥耐藥的機制可能抑制P-gp表達采用K562/DOX細胞嫁接法建立了動物耐藥模型，隨時間的延長，DOX-N組與DOX-I組的腫瘤體積相比明顯減小，差異有顯著性。DOX-N組的抑瘤率高達為67.97％，遠高于DOX-I組(16.12％)。體外細胞和在體實驗說明，DOX-N有效克服了多藥耐藥。 本論文的研究，將為這些制劑克服