1、精子DNA碎片（sperm DNA fragmentation，SDF）已經(jīng)成為反映男性生育能力的一個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)和臨床指標(biāo)。高SDF影響自然生育和宮腔內(nèi)人工授精等體內(nèi)受精方式的生育能力。但SDF對(duì)常規(guī)體外受精（in vitro fertilization，IVF）和單精子卵胞漿內(nèi)注射術(shù)(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的臨床結(jié)果和出生后代的影響仍未定論。而這一問(wèn)題在目前IVF和ICSI廣泛應(yīng)

2、用于精液異常的男性不育癥的時(shí)代尤顯重要，因?yàn)槟行跃褐笜?biāo)異常不育患者存在明顯增高的SDF。本研究分三個(gè)部分:1、通過(guò)臨床研究闡明SDF對(duì)IVF和ICSI的臨床結(jié)果的影響;2、通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究高SDF對(duì)ICSI小鼠子代的遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)影響，探討SDF對(duì)ICSI后代影響的機(jī)制;3、探討環(huán)境污染物鄰苯二甲酸二-2-乙基己基酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)對(duì)SDF的影響以及其產(chǎn)生生殖毒性的機(jī)制。
　　

3、第一部分精子DNA碎片對(duì)IVF和ICSI臨床結(jié)果的影響
　　回顧性分析了2009年4月至2012年12月期間在本生殖中心就診的連續(xù)3350個(gè)首次IVF和ICSI周期。正常卵巢儲(chǔ)備功能女性病人采取標(biāo)準(zhǔn)黃體期降調(diào)長(zhǎng)方案(standard leuteal down regulation long regimen，LP)治療，潛在卵巢儲(chǔ)備功能下降的女性病人則采用短方案(short flare-up regimen，SP)。采用SP的具體條

4、件是基礎(chǔ)FSH＞10 IU/L或基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)＜6或年齡≥38歲。在病人進(jìn)入周期前1-2個(gè)月，采用染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(sperm chromatin dispersion，SCD)對(duì)所有男性病人行精子DNA損傷程度檢測(cè)。將所有病例分為L(zhǎng)P/IVF、LP/SCSI、SP/IVF和SP/ICSI等4組，將SDF分析閾值分別定為20％、30％和40％。分析4組中SDF值與IVF或ICSI的受精率、卵裂率、早期胚胎質(zhì)量、胚胎種植率(implantat

5、ionrate，IR)、臨床妊娠率(clinical pregnancy rate，CPR)和早期流產(chǎn)率等臨床結(jié)果的關(guān)系。結(jié)果表明:在LP/IVF組，當(dāng)SDF≥20％和≥30％時(shí)， IR顯著下降，CPR也有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義;當(dāng)SDF≥40％時(shí)，早期流產(chǎn)率顯著增加;不同SDF閾值時(shí)，高SDF組與低SDF組的受精率和早期胚胎質(zhì)量均無(wú)顯著性差異。在LP/ICSI組，高SDF組與低SDF組的各項(xiàng)臨床結(jié)果均無(wú)顯著差異。然而，在SP/

6、IVF組和SP/ICSI組，當(dāng)SDF閾值分別為20％，30％和40％時(shí)，各組高水平SDF與IVF和ICSI的IR和CPR均有顯著的負(fù)相關(guān);在SP/ICSI組，高SDF顯著影響受精率及胚胎質(zhì)量。研究結(jié)果表明:SDF影響IVF和ICSI的臨床結(jié)果，在卵巢儲(chǔ)備功能低下的病人中尤為顯著;這提示卵子質(zhì)量在SDF對(duì)IVF和ICSI的影響中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分精子DNA碎片對(duì)子代遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的影響
　　輔助生殖技術(shù)(Assi

7、sted Reproductive Technology, ART)是解決低生育力夫婦生育問(wèn)題的有效治療手段，然而其安全性問(wèn)題，特別是不育人群本身攜帶的遺傳缺陷對(duì)子代遺傳及表觀遺傳的影響鮮有深入研究。本研究旨在研究DNA損傷精子行ICSI獲得的子代，通過(guò)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠-Big Blue(R)這種公認(rèn)的突變檢測(cè)模型來(lái)探討其遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)是否發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)以B6D2F1(C57BL/6×DBA/2)野生型小鼠和Big Blue(R)小鼠

8、作為精子和卵子供體。將其精子反復(fù)凍融后獲得DNA損傷精子，繼而利用ICSI-ET技術(shù)獲得子代。通過(guò)收集孕中期胚胎，提取全基因組DNA、回收及體外包裝λ噬菌體、鋪板展示、lacI突變體篩選、擴(kuò)增測(cè)序等等，最終確定精子DNA損傷誘導(dǎo)子代基因組點(diǎn)突變的發(fā)生率。另一方面，通過(guò)對(duì)孕中期胚胎印記基因H19和Snrpn DMR甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究，以期探討精子DNA損傷是否引起表觀遺傳學(xué)上的變化。研究發(fā)現(xiàn)，以Big Blue(R)轉(zhuǎn)基因小鼠為精子供體的

9、胎鼠，檢測(cè)突變的lacI基因位于親代精子上，那么子代基因組若發(fā)生突變則來(lái)源于父源性突變，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組突變率（1.45±0.34）×10-5顯著高于對(duì)照組（1.03±0.09）×10-5的突變率水平(P=0.0049);而以Big Blue(R)轉(zhuǎn)基因小鼠為卵子供體的胎鼠，因?yàn)闄z測(cè)突變的lacI基因位于親代卵子上，子代基因組若發(fā)生突變則來(lái)源于母源性突變，實(shí)驗(yàn)組突變率（1.64±0.22）×10-5顯著高于對(duì)照組（0.98±0.12）×

10、10-5的突變率水平(P=0.0008)。同時(shí)，印記基因H19和Snrpn DMR的甲基化水平也發(fā)生顯著變化，其中H19異常高甲基化（實(shí)驗(yàn)組69.9％ vs.對(duì)照組52.5％，P=0.0375），Snrpn異常低甲基化(實(shí)驗(yàn)組31.5％ vs.對(duì)照組53.0％，P=0.0451)。本研究結(jié)果顯示，精子DNA損傷將對(duì)子代遺傳和表觀遺傳的穩(wěn)定性產(chǎn)生重大風(fēng)險(xiǎn)，提示在ART診療過(guò)程中，配子自身攜帶的遺傳缺陷對(duì)子代健康的影響應(yīng)當(dāng)引起廣泛重視。

11、r>　　第三部分鄰苯二甲酸二-（2-乙基己基）酯對(duì)精子DNA損傷、體外受精及其胚胎發(fā)育潛能的影響
　　鄰苯二甲酸二-（2-乙基己基）酯(di-(2-ethylhcxyl)phthalate，DEHP）作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的工業(yè)污染物，其生殖毒性作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。我們通過(guò)小鼠體外受精-胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)研究低劑量DEHP(1μg/ml)離體暴露對(duì)精子受精過(guò)程和胚胎發(fā)育潛能的影響。同時(shí)，借助Big Blue(R)轉(zhuǎn)基因小鼠這種公認(rèn)的突

12、變檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)在體染毒(500 mg/kg/day)探討DEHP對(duì)睪丸基因組突變率的影響。離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，低劑量DEHP暴露(1μg/ml，30min)能夠顯著影響受精率和后續(xù)的胚胎發(fā)育過(guò)程(P＜0.05)，移植胚胎的出生率也顯著下降(P＜0.05)。我們同時(shí)收集小鼠體內(nèi)受精的受精卵和2-cell胚胎進(jìn)行體外暴露培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)（1μg/ml），發(fā)現(xiàn)受精卵的后續(xù)發(fā)育顯著受損而2-cell胚胎的發(fā)育潛能與對(duì)照組差異不大，提示低劑量D

13、EHP離體暴露能夠?qū)κ芫^(guò)程和胚胎發(fā)育潛能產(chǎn)生顯著影響，而其作用位點(diǎn)主要集中在受精過(guò)程和第一次卵裂階段。在小鼠在體染毒實(shí)驗(yàn)中，4周的DEHP染毒能夠顯著增加睪丸基因組的突變率，約為對(duì)照組的3倍(P＜0.05)。而對(duì)離體暴露和在體染毒的精子進(jìn)行DNA損傷檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，DEHP并未顯著提高精子DNA損傷程度?？偟膩?lái)說(shuō)，無(wú)論是離體暴露影響受精過(guò)程和胚胎發(fā)育潛能，還是在體染毒對(duì)睪丸基因組的致突變作用，DEHP對(duì)人類(lèi)生殖健康都存在巨大威脅，而這種生