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![A族鏈球菌M蛋白在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化及調(diào)節(jié)中的作用.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/19/12/8e18dc72-0e38-471b-b3ae-fb507a0f7add/8e18dc72-0e38-471b-b3ae-fb507a0f7add1.gif)
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1、目的:
A族鏈球菌(GroupAstreptococcus,GAS)是一種以人類為唯一宿主的細(xì)菌,感染后若治療不及時(shí)可引發(fā)多種嚴(yán)重的疾病。本室在GAS致炎機(jī)制及免疫逃逸方面做了大量工作。M蛋白位于GAS的表面,是它的主要的毒力因子,研究顯示M蛋白有著較強(qiáng)的致炎能力,且有助于GAS逃避巨噬細(xì)胞的吞噬。結(jié)合本室前期工作,本課題對(duì)M蛋白在誘導(dǎo)及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化方面做繼續(xù)研究。
巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的效應(yīng)細(xì)胞,活化的巨
2、噬細(xì)胞可以分泌促炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等,這些因子在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用。炎癥的發(fā)展過程中受許多負(fù)調(diào)控因子的作用,我們對(duì)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(A20)予以了特別的關(guān)注,A20是炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的中心——轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制因子,而M蛋白對(duì)A20的誘導(dǎo)產(chǎn)生,發(fā)揮作用有著怎樣的影響?同時(shí)IL-10是一種強(qiáng)烈的抑制單核巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的細(xì)胞因子,在巨噬細(xì)胞受到M蛋白刺激時(shí)它的表達(dá)情況如何?細(xì)胞因
3、子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子(SOCS)是細(xì)胞信號(hào)JAK/STAT通路以及MYD88/NF-κB通路的負(fù)調(diào)控因子,在M蛋白所致巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)展過程中它的表達(dá)量如何?對(duì)于以上疑問,本課題旨在做初步研究。因此,在本研究中我們首先表達(dá)了M蛋白,同時(shí)構(gòu)建并表達(dá)另一種由GAS分泌的蛋白SpeB作為對(duì)照蛋白,通過對(duì)比兩種蛋白分別刺激巨噬細(xì)胞后的促炎細(xì)胞因子及相關(guān)負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)情況來驗(yàn)證M蛋白是否與其他GAS相關(guān)蛋白在促進(jìn)炎癥以及表達(dá)負(fù)調(diào)控因子方面是否存在差異
4、,以期為今后在M蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞負(fù)調(diào)控因子表達(dá)方面更深入的研究奠定基礎(chǔ)。
通過以上工作,旨在深化對(duì)于GAS的認(rèn)識(shí),以期為臨床更精確的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1、目的蛋白制備:將本室已有的含有M蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGX2-T的貯存菌DH-5α提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染表達(dá)菌E.coliBL21,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)M蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定后,純化,定量。構(gòu)建SpeB蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SpeB
5、,轉(zhuǎn)染表達(dá)菌E.coliBL21后表達(dá)蛋白,純化,定量。
2、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及蛋白作用濃度的選擇:首先MTT法檢測(cè)M蛋白和SpeB蛋白的細(xì)胞毒性,鱟試劑盒檢測(cè)融合蛋白LPS含量,然后參考以0.1、1、5、10μg/ml濃度的M蛋白作用于巨噬細(xì)胞RAW264.7后A20的表達(dá)情況,以確定適合刺激濃度。
3、以PBS為陰性對(duì)照,以LPS為陽性對(duì)照(用量10ng/μl),M蛋白和SpeB蛋白分別刺激RAW264.7
6、細(xì)胞后細(xì)胞因子的表達(dá):以10μg/ml濃度的M蛋白和SpeB蛋白分別刺激RAW264.7細(xì)胞2、4、8、12小時(shí)后行Realtime-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及負(fù)調(diào)控因子A20、IL-10、SOCS1和SOCS3的mRNA表達(dá)水平。
4、M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞后A20、P65及TRAF6的表達(dá):以10μg/ml濃度的M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)后Westernbl
7、ot檢測(cè)P65,A20及其下游分子TRAF6。
5、M蛋白刺激C57小鼠BMDM細(xì)胞后A20、P65及TRAF6的表達(dá):以10μg/ml濃度的M蛋白刺激小鼠BMDM細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)后Westernblot檢測(cè)P65,A20及其下游分子TRAF6。
結(jié)果:
1、表達(dá)并純化M蛋白,蛋白定量濃度為160μg/ml。構(gòu)建、表達(dá)、并純化SpeB蛋白,蛋白定量75μg/ml。
2、經(jīng)
8、MTT檢測(cè)顯示M蛋白濃度小于20μg/ml的時(shí)候?qū)?xì)胞無毒性,LPS含量為1.015ng/μl;SpeB蛋白小于16μg/ml的時(shí)候?qū)?xì)胞無毒性,LPS含量為0.786ng/μl。確定以10μg/ml作為蛋白作用濃度。
3、M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞2、4、8、12小時(shí)后行Realtime-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6各細(xì)胞因子較對(duì)照均表達(dá)增高,多個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著性差異(P<0.05)。其中IL-1
9、β和IL-6較TNF-α增高明顯,在8小時(shí)左右達(dá)峰值。負(fù)調(diào)控因子方面A20表達(dá)增高明顯,在4小時(shí)左右達(dá)到高峰,與對(duì)照相比,除4小時(shí)外皆有顯著性差異(P<0.05)。IL-10、SOCS1和SOCS3均有不同程度增高。同時(shí)用SpeB蛋白做平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示TNF-α、IL-1β、IL-6各細(xì)胞因子較對(duì)照均表達(dá)增高,但相對(duì)低于M蛋白刺激后的結(jié)果,而負(fù)調(diào)控因子A20、SOCS1和SOCS3的表達(dá)顯著低于M蛋白刺激后的結(jié)果,IL-10的表達(dá)更是
10、低于正常對(duì)照。
4、M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)后經(jīng)Westernblot檢測(cè)顯示A20表達(dá)量在12小時(shí)以前呈逐漸增高,24小時(shí)A20的表達(dá)與12小時(shí)比較是降低的。M蛋白刺激RAW264.7細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)后行Westernblot檢測(cè)P65和TRAF6結(jié)果顯示P65表達(dá)增高明顯且在24小時(shí)以內(nèi)持續(xù)增高,表明NF-κB通路處于被激活的狀態(tài),而TRAF6的表達(dá)量在24小時(shí)內(nèi)呈動(dòng)態(tài)變化,即8小
11、時(shí)和24小時(shí)的變化量要分別低于4小時(shí)和12小時(shí)。
5、M蛋白相同條件刺激BMDM細(xì)胞4、8、12、24小時(shí)行Westernblot檢測(cè)A20結(jié)果顯示A20在12小時(shí)以內(nèi)的表達(dá)量逐漸增高,24小時(shí)后的表達(dá)量低于12小時(shí);P65的表達(dá)在24小時(shí)內(nèi)是逐漸增高的而TRAF6的變化趨勢(shì)與RAW264.7細(xì)胞相同。
結(jié)論:
1、M蛋白和SpeB蛋白均能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF
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