1、目的:探討與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子TWIST與雌激素受體α(ERα)之間分子水平和功能上的調(diào)控關(guān)系及其乳腺癌臨床的意義。
　　 方法:首先，構(gòu)建了pcDNA5-TWIST穩(wěn)定表達細胞系;其次，為了鑒定出人類基因組中潛在的TWIST結(jié)合位點，用HEK293-TWIST細胞系和陰性對照的HEK293細胞系來進行ChIP測序分析;然后，為了檢驗表達HEK293-TWIST的細胞中NuRD復合物的各組分是否也被募集到ESR1基因上的

2、TWIST結(jié)合部位，相繼作了ChIP和ChIP-re-ChIP實驗分析;再次，為了確定乳腺癌細胞系中TWIST與ERα的表達關(guān)系，通過RT-PCR和Western blot方法，檢測了5個不同類型的乳腺癌細胞系中ESR1(ERα基因)的mRNA和蛋白質(zhì)水平;為了檢測與ESR1基因結(jié)合的TWIST/NuRD的相關(guān)區(qū)域是否具有抑制ESR1基因轉(zhuǎn)錄的功能，本課題完成了如下實驗:1、完成了熒光素報告基因分析技術(shù);2、為了檢測外源性TWIST的表

3、達是否抑制內(nèi)源性ERα的表達，本課題在乳腺癌細胞中做了TWIST的RNA干擾技術(shù)和細胞轉(zhuǎn)染過表達技術(shù)，使TWIST基因沉默和過表達進行分析;最后，為了檢測人類乳腺癌患者中TWIST與ERα表達的關(guān)系及可能的臨床意義，實驗中收集了28例乳腺浸潤性導管癌患者的腫瘤組織，抽提mRNA，用半定量RT-PCR和免疫組織化學方法檢測了TWIST和ERα的mRNA和蛋白質(zhì)水平。
　　 結(jié)果:建立了HEK293-TWIST細胞系及其陰性對照的H

4、EK293細胞系;應用該細胞系，進行ChIP測序分析，發(fā)現(xiàn)了一個位于人類ERα基因(ESR1)內(nèi)含子7上的與TWIST結(jié)合的關(guān)鍵DNA區(qū)域;再通過ChIP-re-ChIP實驗，揭示了HEK293-TWIST細胞系中，在ESR1基因上的TWIST結(jié)合區(qū)域中，與TWIST結(jié)合的NuRD復合物重要組分Mi-2， MTA2和HDAC2均結(jié)合到人類ERα基因(ESR1)內(nèi)含子7上的關(guān)鍵DNA區(qū)域。這說明了TWIST可以有效地將NuRD復合物募集到

5、ESR1基因上的TWIST結(jié)合區(qū)域;在高侵襲性的ERα表達陰性的SUM1315、MDA-MB-435和MDA-MB-231細胞系中，用RT-PCR和Western blot檢測出高水平的TWIST mRNA和蛋白質(zhì)表達，而在低侵襲性且高表達ERα的T47D和MCF-7細胞系中沒有檢測出TWIST的mRNA和蛋白質(zhì)水平。在熒光素報告基因分析實驗中，將TWIST結(jié)合的關(guān)鍵DNA區(qū)域克隆到pGL3-Pro-Luc報告基因上而構(gòu)建成pGL3-3

6、32ESR1-Pro-Luc報告基因，再將pGL3-332ESR1-Pro-Luc報告基因質(zhì)粒和TWIST表達載體共轉(zhuǎn)染入HEK293細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達的TWIST顯著地抑制了這個報告基因的活性，而對照組將pGL3-Pro-Luc和TWIST共轉(zhuǎn)染的細胞中，TWIST的過表達并沒有抑制對照組中pGL3-Pro-Luc這個報告基因的熒光素酶活性。顯示ESR1基因上的TWIST/NuRD的相關(guān)區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄抑制功能;在TWIST的RNA干擾

7、和細胞轉(zhuǎn)染過表達實驗中，分析結(jié)果揭示了在MDA-MB-435和4T1細胞系中使TWIST基因沉默，ERα的mRNA表達提高了2.5-3倍;在T47D細胞系中過表達TWIST，抑制了ERα的mRNA和蛋白的表達;在MCF-7細胞系中過表達TWIST，降低了細胞中的ERα的mRNA和蛋白表達水平，說明TWIST能抑制ERα的表達;HDAC抑制劑—TSA，或者基因沉默TWIST均能夠解除TWIST對ERα的抑制作用。最后，我們收集28例侵襲性

8、乳腺癌組織進行RT-PCR和免疫組化實驗，發(fā)現(xiàn)有17位(61％)腫瘤患者具有TWIST的mRNA與蛋白高水平的表達而ERα的mRNA和蛋白低水平表達或無法檢測到，7位(25％)腫瘤患者具有TWIST的mRNA和蛋白質(zhì)低水平表達或者無法檢測到而ERα的mRNA和蛋白質(zhì)呈現(xiàn)高水平表達，2位(7％)腫瘤患者中TWIST和ERα的mRNA，蛋白質(zhì)水平都增高，另2位(7％)腫瘤患者TWIST和ERα的mRNA，蛋白質(zhì)水平都降低。這些結(jié)果顯示在86

9、％的侵襲性乳腺癌組織中，TWIST的表達與ERα表達呈負相關(guān)。
　　 結(jié)論:揭示了TWIST表觀遺傳學抑制ERα表達的分子機制;在TWIST表達陽性的乳腺癌細胞中，TWIST通過招募NuRD復合物，從而抑制了ERα的表達;TWIST表達與ERα的蛋白表達呈負相關(guān);ERα在乳腺癌細胞中的表達和抑制是一個可逆的過程。在這些ERα表達被抑制的乳腺癌細胞中我們使用HDAC抑制劑—TSA，或者基因沉默TWIST而重新恢復ERα表達，可望在