1、高致病性禽流感(HPAI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一類禽類病毒性傳染病。該病不但嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的發(fā)展和國際貿(mào)易，而且對人類健康也構(gòu)成越來越大的威脅。常規(guī)滅活苗對控制禽流感的發(fā)生流行起到了非常重要的作用，但也存在難以克服的缺點(diǎn)，如存在散毒的潛在危險(xiǎn)、不能有效激發(fā)細(xì)胞和黏膜免疫應(yīng)答等，因此需要研究一種安全、高效的新型疫苗克服上述不足。 減毒沙門菌可作為疫苗載體，通過自然黏膜感染途徑運(yùn)送DNA疫苗至宿主特定的免疫器官和細(xì)胞，表

2、達(dá)外源抗原，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的細(xì)胞、體液和黏膜免疫應(yīng)答。減毒沙門菌作為載體可用于運(yùn)送禽流感DNA疫苗，為禽流感的防治帶來新思路和新手段。 沙門菌侵入細(xì)胞后并不能迅速進(jìn)入胞液并釋放內(nèi)含的DNA疫苗，已經(jīng)成為重組沙門菌疫苗載體研究的阻礙之一。本研究構(gòu)建了一種鎂離子調(diào)控的沙門菌裂解系統(tǒng)，該系統(tǒng)在胞內(nèi)低鎂離子濃度下會發(fā)生裂解，從而釋放出所攜帶的DNA疫苗。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建出運(yùn)送禽流感DNA疫苗的減毒鼠傷寒沙門菌，并對其免疫特性作初步探

3、討。 1鎂離子誘導(dǎo)裂解型沙門菌運(yùn)送系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定將本室構(gòu)建的融合基因“S107”插入非抗性篩選DNA疫苗載體pPL的Mlu I位點(diǎn)，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pPL107。融合基因“S107”是由將Mg2+運(yùn)輸?shù)鞍谆騧gtC/B的啟動子Pmgt置于λ噬菌體裂解基因之前構(gòu)建成功，這樣可以通過控制培養(yǎng)基中Mg2+的濃度使裂解基因在沙門菌中表達(dá)。將紅色熒光蛋白DsRed基因分別連入pPL107和pPL中，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pPL107DsR

4、ed和pPLDsRed。重組表達(dá)質(zhì)粒pPL107DsRed和pPLDsRed分別轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，24h后，在熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)烈的紅色熒光。上述重組表達(dá)質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入SifA基因突變型鼠傷寒沙門菌X4550°，經(jīng)篩選鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)化子，分別命名為X4550*(pPL107DsRed)和X4550*(pPLDsRRed)。 將X4550*(pPL107DsRed)和X4550*(pPLDsRed)預(yù)培養(yǎng)的菌液分別洗滌，并

5、重懸于N基礎(chǔ)培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基中Mg2+濃度很低時(shí)，融合基因“S107”發(fā)生表達(dá)，X4550*(pPL107DsRed)在2h內(nèi)就會發(fā)生裂解，約80％的細(xì)菌死亡，并可在溶液中檢測出釋放的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPL107DsRed，當(dāng)在培養(yǎng)基中添加了足量的Mg2+時(shí)，融合基因“S107”的表達(dá)就會受到抑制。X4550*(pPL107DsRed)LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，其生長能力與X4550*(pPLDsRed)沒有明顯差異。體外真核表達(dá)質(zhì)粒遞送試

6、驗(yàn)顯示，X4550*(pPL107DsRed])可以將真核表達(dá)質(zhì)粒運(yùn)送給巨噬細(xì)胞系RAW264.7，并表達(dá)紅色熒光蛋白，說明該系統(tǒng)可將自身攜帶的DNA疫苗傳遞給真核細(xì)胞。本研究獲得了在體內(nèi)自我誘導(dǎo)宿主菌有效裂解釋放DNA疫苗的方法，這為進(jìn)一步研究和利用該DNA疫苗輸送系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。 2鎂離子誘導(dǎo)裂解型沙門菌運(yùn)送H5亞型禽流感病毒DNA疫苗免疫原性的初步研究利用限制性內(nèi)切酶BamH I和Nhe I切出pVAXl-HA上的HA基因

7、，并連入相應(yīng)酶切的pPL107和pPL載體中，BamH I和Nhe I酶切電泳鑒定正確，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPL107HA和pPLHA。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，間接免疫熒光試驗(yàn)表明，HA基因在COS-7細(xì)胞中獲得表達(dá)。通過電穿孔轉(zhuǎn)化法，將pPLl07HA和pPLHA轉(zhuǎn)入StfA基因突變型減毒鼠傷寒沙門菌X4550*中，抽提質(zhì)粒后酶切鑒定正確，從而獲得攜帶DNA疫苗的重組沙門菌，分別命名為X4550*(pPL107HA)和X4550

8、*(pPLHA)。重組菌X4550*(pPL107HA)和X4550*(pPLHA)以每只1 × 107 CFU的劑量靜脈注射免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，兩周后以同樣的方法進(jìn)行第二次免疫。二免后兩周，各重組菌免疫組測得的針對禽流感病毒HA蛋白的特異性血清抗體都較低。用制備的H5亞型禽流感病毒作腹腔注射，2周后重組菌X4550*(pPL107HA)和X4550*(pPLHA)均可測得針對禽流感病毒HA蛋白的特異性血清抗體，并且重組菌X

9、4550*(pPL107HA)免疫組與重組菌X4550*(pPLHA)免疫組能激發(fā)出較對照組更強(qiáng)的血清抗體水平。在刺激小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖方面，各免疫組在二免后兩周均能刺激淋巴細(xì)胞增殖，但重組菌X4550*(pPL107HA)免疫組可以激發(fā)出較X4550*(pPLHA)免疫組以及對照組更強(qiáng)的針對HA蛋白的細(xì)胞免疫應(yīng)答，差異顯著(P<0.05)。上述結(jié)果說明，對于沙門菌介導(dǎo)的DNA疫苗來說，提高沙門菌釋放DNA疫苗的能力有助于提高免疫效