1、本研究對(duì)小鼠早期胚胎進(jìn)行性別鑒定，獲得雄性胚胎后與孤雌激活胚胎進(jìn)行聚合培養(yǎng)，其目的是為了建立一種新的異性胚胎嵌合培養(yǎng)模式，在便于通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)不同來(lái)源胚胎發(fā)育效果進(jìn)行性別檢測(cè)的基礎(chǔ)上，研究?jī)煞N不同類型胚胎細(xì)胞之間在嵌合發(fā)育過(guò)程中的相互影響，為從嵌合發(fā)育胚胎中分析標(biāo)記來(lái)源于孤雌胚胎的干細(xì)胞研究過(guò)程奠定基礎(chǔ)。本研究初步建立了構(gòu)建孤雌激活胚胎與雄性胚胎嵌合胚的方法與程序，對(duì)該過(guò)程中的幾個(gè)影響因素做了初步的探討。主要研究結(jié)果如下：

2、 1.雙重PCR法鑒定小鼠早期胚胎性別研究 對(duì)引物設(shè)計(jì)的合理性以及雙重PCR對(duì)早期胚胎性別鑒定的效果進(jìn)行探討，以期解決單對(duì)Sty基因引物擴(kuò)增時(shí)易出現(xiàn)假陰性的問(wèn)題，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系。 (1)引物設(shè)計(jì)及其合理性檢測(cè)：自主設(shè)計(jì)公鼠所特有的Sry基因引物SRY250U/SRY250L和公母小鼠所共有的Zfx基因引物ZFX399U/ZFX399用于小鼠性別鑒定。應(yīng)用所設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物分別對(duì)公母小鼠肝臟組織基因組進(jìn)行體外擴(kuò)增。結(jié)果顯

3、示，兩對(duì)引物均能有效的對(duì)上述基因進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生特異的DNA片段，與理論設(shè)計(jì)相符。 (2)雙重PCR鑒定小鼠肝臟組織細(xì)胞性別研究為了杜絕單一Sry基因擴(kuò)增失敗或胚胎丟失導(dǎo)致的假陰性現(xiàn)象，本試驗(yàn)應(yīng)用上述雙重PCR分別對(duì)已知性別的4只公鼠和4只母鼠肝臟組織基因組進(jìn)行性別鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)公鼠有339bp的Zfx基因序列片段和250bp的Sry基因序列片段，而母鼠則只有339bp的Zfx基因序列片段，證明運(yùn)用經(jīng)優(yōu)化的雙重PCR體系能夠有效擴(kuò)

4、增出所需基因序列，能夠用于小鼠性別的判定。 (3)小鼠早期胚胎性別鑒定最適胚胎模板量研究應(yīng)用前面試驗(yàn)優(yōu)化的性別鑒定體系分別以4個(gè)和2個(gè)胚胎卵裂球?yàn)槟０鍖?duì)小鼠8-細(xì)胞胚胎進(jìn)行了性別鑒定。結(jié)果顯示，以4個(gè)卵裂球?yàn)槟０宓男坌院痛菩耘咛ケ嚷?17/19，0.89)更接近1.所以在早期胚胎性別鑒定中取4個(gè)卵裂球?yàn)槟０甯鼙ＷC鑒定的準(zhǔn)確性。 2.不同化學(xué)方法對(duì)小鼠卵母細(xì)胞激活效果研究 (1)單個(gè)激活劑(乙醇、SrCl2)不同

5、處理時(shí)間對(duì)小鼠母細(xì)胞孤雌激活效果的影響本試驗(yàn)旨在探討乙醇和SrCl2不同處理時(shí)間對(duì)小鼠母細(xì)胞孤雌激活效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，10mmol/L SrCl2處理卵母細(xì)胞6h比單獨(dú)使用7％乙醇處理會(huì)獲得更好的激活效果，其的激活率、2～8細(xì)胞胚胎率、囊胚率分別為72.38％、69.52％、29.52％。 (2)乙醇、Srcl：與6-DMAP聯(lián)合激活不同處理時(shí)間對(duì)小鼠卵母細(xì)胞激活效果的影響本試驗(yàn)旨在探討乙醇、SrCl2分別與6-DMAP

6、聯(lián)合，不同處理時(shí)間對(duì)小鼠卵母細(xì)胞激活效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，用7％的乙醇對(duì)卵母細(xì)胞處理5min后再用2.5 mmol/L 6-DMAP作用4h的方式激活得到的激活率(89.58％)和囊胚率(38.54％)最高，另外用10mmol/L SrCl2處理卵母細(xì)胞4h后再用2.5 mmol/L 6-DMAP作用4h的方式也可以獲得激活率84.85％、2～8細(xì)胞率65.66％的激活效果。 3.小鼠雄性胚胎與孤雌胚胎嵌合體制作及培養(yǎng)研究

7、 (1)不同去帶液對(duì)胚胎聚合效果的影響本試驗(yàn)旨在考察不同濃度的鏈蛋白酶液，不同處理時(shí)間對(duì)8-細(xì)胞胚胎取帶效果以及發(fā)育情況的影響。研究結(jié)果表明，0.25％鏈蛋白酶處理10min的胚胎聚合率(86.36％)和發(fā)育率(75.73％)較高，但裸胚率(32.35％)較低；0.5％鏈蛋白酶液處理卵母細(xì)胞20min的裸胚率較高，但胚胎發(fā)育情況較差。在考慮到去帶效率和去帶效果兩個(gè)因素，選擇0.5％鏈蛋白酶液處理卵母細(xì)胞10min的最理想，可獲得3

8、8.03％的裸胚率和81.48％的胚胎聚合率。 (2)不同培養(yǎng)體系對(duì)雄性胚胎與孤雌胚胎嵌合體發(fā)育影響的研究本試驗(yàn)旨在探討不同聚合培養(yǎng)體系對(duì)雄性胚胎與孤雌胚胎嵌合體發(fā)育的影響。研究結(jié)果表明，自制凹窩培養(yǎng)體系對(duì)聚合胚胎的培養(yǎng)效果比PHA微滴培養(yǎng)體系好，其聚合胚胎率、聚合胚胎發(fā)育率以及囊胚率也較高，分別為72.7％、30.3％和15.1％。 結(jié)論：雙重PCR法鑒定小鼠早期胚胎性別，以4個(gè)卵裂球?yàn)镈NA擴(kuò)增的模板量，鑒定8-細(xì)胞

9、胚胎性別的有效率可達(dá)到92.3％。成熟的卵母細(xì)胞使用7％的乙醇處理5min后再用2.5mmol/L 6-DMAP作用4h的激活方式能夠獲得數(shù)量與質(zhì)量都比較好的孤雌胚胎，將已知性別的雌雄兩種早期胚胎在0.5％鏈蛋白酶液中處理10min去除透明帶的效果比較好，將這種來(lái)源不同的兩性胚胎通過(guò)自制的凹窩培養(yǎng)體系直接通過(guò)相互接觸而比較容易聚合發(fā)育，其嵌合發(fā)育至囊胚的比率達(dá)到了30.3％。該結(jié)果為后期利用兩性嵌合胚胎囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)提取干細(xì)胞，并通過(guò)