1、目的:
　　研究重組人促血小板生成素(recombinant human thrombopoietin,rhTPO)在大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)化學性缺氧的保護作用及可能的機制。為臨床上治療缺血缺氧性腦損傷尋求更為有效的治療措施和提供一定的實驗依據。
　　方法:
　　1.用化學缺氧劑氯化鈷(CoCl2)模擬PC12細胞化學性缺氧,應用重組人促血小板生成素建立抗CoCl2誘導的PC12細胞損傷的保護模型;

2、>　　2.應用四甲基偶氮唑鹽比色法(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑,MTT)進行細胞毒性的判斷,檢查PC12細胞的存活率;
　　3.AnnexinⅤ/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡;
　　4.細胞內活性氧(ROS)檢測:活性氧檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit),利用熒光探針 DCFH-DA染色熒光顯微鏡檢測細胞內氧自由基（Reactive Oxygen

3、Species,ROS)的含量。
　　5.線粒體膜電位的檢測:JC-1染色,熒光顯微鏡下觀察細胞內紅綠光的強度并攝片,利用軟件計算出各視野紅綠光的比值;流式細胞術檢測細胞膜電位的變化;
　　6.利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數據,數據用均數±標準誤表示,檢驗水準P<0.05。
　　結果:
　　1.CoCl2抑制PC12細胞生長具有濃度依賴性:化學性缺氧模擬劑CoCl2可以明顯抑制PC12細胞的生長,MTT比色法

4、檢測顯示,CoCl2刺激濃度(200,400,600,800,1000μmol/L)分別作用PC12細胞24h后,細胞存活率顯著降低,因此,在后續(xù)實驗中以500μmol/L濃度的CoCl2作用24h作為化學性缺氧的模型。
　　2.TPO可促進 PC12細胞生長:MTT比色法檢測顯示,25-100ng/ml濃度范圍內干預PC12細胞48h后促進PC12細胞生長且呈濃度依賴性,其中100ng/ml的TPO的保護作用最顯著。根據實驗結果

5、,選取100ng/ml TPO作為本實驗的保護濃度。TPO保護PC12對抗CoCl2誘導的細胞毒性作用,實驗結果證明,經600μmol/L濃度CoCl2處理后的PC12加入100ng/ml濃度的TPO作用48小時可以有效抑制由PC12細胞的毒性作用。故在后續(xù)實驗中采用100ng/ml的TPO作為保護濃度。
　　3.流式細胞術檢測顯示:500μmol/L的CoCl2引起的PC12細胞損傷再經100ng/ml TPO處理48h后,其凋

6、亡數量有明顯減少的趨勢,與對照組比較有統(tǒng)計學意義。
　　4.TPO可以降低CoCl2誘導的細胞內 ROS生成:活性氧檢測試劑盒結果顯示,500μmol/L的CoCl2處理6小時后,細胞內ROS含量增加,而再經100ng/ml TPO干預12h后熒光強度明顯減弱,但100ng/ml的TPO本身不會影響胞內ROS的生成,結果提示TPO可以抑制CoCl2誘導的細胞內ROS生成增多。
　　5.TPO可以抑制CoCl2引起的細胞內線粒

7、體膜電位的降低:流式細胞術JC-1染色顯示,500μmol/L的CoCl2處理24小時后,胞內線粒體膜電位顯著降低,但經由100ng/ml TPO干預48h,可以明顯抑制胞內線粒體膜電位的降低。表明,TPO可通過抑制線粒體膜電位的降低來保護細胞的缺氧損傷。
　　結論:
　　1.CoCl2模擬化學性缺氧引起PC12細胞損傷,使PC12細胞存活率降低,胞內活性氧生成增多以及細胞線粒體膜電位降低。
　　2.TPO可以對抗Co