1、布魯氏菌病主要引起家畜的流產(chǎn)、死胎、睪丸炎等癥狀，給畜牧業(yè)的生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌沒有典型的外毒素，其毒力主要表現(xiàn)在對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲力和自身繁殖力上。外膜蛋白是布魯氏菌的主要毒力因子，與細(xì)菌的黏附和定殖密切相關(guān)。OMP25蛋白是布魯氏菌中重要的外膜蛋白，在維持細(xì)菌自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和展現(xiàn)細(xì)菌毒力上有重要作用，缺失 OMP25蛋白后，布魯氏菌的毒力明顯下降。MAPK信號(hào)通路是普遍存在于真核細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以被病原菌、細(xì)胞因子

2、等信號(hào)激活，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究外膜蛋白 OMP25與 MAPK信號(hào)通路的關(guān)系，了解外膜蛋白對(duì)信號(hào)通路的激活情況，以及對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響，為進(jìn)一步研究布魯氏菌的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。圍繞以上觀點(diǎn)開展如下研究：
　　篩選并鑒定布魯氏菌 OMP25缺失株和2308侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)顯著表達(dá)的細(xì)胞因子。建立布魯氏菌 OMP25缺失株和2308侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞模型，采用ELISA方法檢測(cè)侵染后0 h，8 h，24 h，4

3、8 h的細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子，確定分泌量差異顯著的細(xì)胞因子。結(jié)果顯示，OMP25組、2308組和 PBS對(duì)照組的 IL-10，IL-1β在各個(gè)時(shí)間段的差異均不顯著；在侵染4 h時(shí)，OMP25缺失株侵染組 IL-1的釋放量顯著低于2308侵染組（P＜0.05）；與2308組相比，OMP25組TNF-α的釋放量在4 h，8 h，24 h，48h均差異顯著。研究表明布魯氏菌侵染宿主細(xì)胞過程中外膜蛋白 OMP25與細(xì)胞因子 TNF-α的釋放量

4、密切相關(guān)。
　　分析布魯氏菌 OMP25對(duì) MAPK信號(hào)通路的影響。建立布魯氏菌 OMP25缺失株和2308侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPT-8)模型，收集侵染細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行磷酸化檢測(cè)。用濃度為10μM的信號(hào)通路抑制劑孵育細(xì)胞1 h，用牛種布魯氏菌布魯氏菌OMP25缺失株和強(qiáng)毒株2308以100:1的比例侵染細(xì)胞。ELISA法檢測(cè)侵染細(xì)胞4 h，8 h，24 h，48 h后細(xì)胞上清液中的 TNF-α的含量，進(jìn)一步通過阻斷實(shí)驗(yàn)對(duì)

5、其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示：在26個(gè)磷酸化的蛋白中，2308激活了 GSK-3a/b、JNK、p38、P70S6Kinase、RSK2、HSP27磷酸化位點(diǎn)。OMP25缺失株激活了 p38γ通路相關(guān)的蛋白磷酸化位點(diǎn)。抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入 p38抑制劑后，OMP25缺失株侵染組與2308侵染組 TNF-α分泌量均降低；加入 JNK和 ERK抑制劑后，OMP25缺失株侵染組中 TNF-α變化不明顯。研究表明布魯氏菌 OMP25缺失株和布魯氏菌2

6、308株激活了 MAPK信號(hào)通路中的 p38支路，且 TNF-α的產(chǎn)生和 p38有關(guān)。
　　檢測(cè)布魯氏菌 OMP25缺失株和2308株感染小鼠時(shí) MAPK信號(hào)通路的激活情況，進(jìn)一步闡述 OMP25在 MAPK信號(hào)通路激活機(jī)制的作用。采用腹腔注射法對(duì)雌性小鼠用布魯氏菌 OMP25缺失株和2308株進(jìn)行感染，收集感染小鼠外周血，并通過血清檢測(cè)IgG和 TNF-α的釋放量，病理切片觀察布魯氏菌 OMP25缺失株和親本株2308對(duì)小鼠的影

7、響，對(duì)布魯氏菌侵染后影響的 MAPK信號(hào)通路進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果顯示布魯氏菌 OMP25缺失株和2308株感染組小鼠后血清中 TNF-α的釋放量均低于對(duì)照組。病理切片結(jié)果顯示與 OMP25缺失株組相比，2308感染組出現(xiàn)明顯的病理變化。免疫組化結(jié)果顯示，OMP25缺失株和2308株侵染的小鼠子宮內(nèi)膜均有 MAPK信號(hào)通路 p38支路和 ERK支路的磷酸化。結(jié)果表明布魯氏菌2308親本株和 OMP25缺失株均促進(jìn)了 TNF-α的表達(dá)，同